Detecção de Intermediários de Recombinação Homóloga via Ligadura de Proximidade e PCR Quantitativa em Saccharomyces cerevisiae
Summary
Os ensaios de captura de loop D (DLC) e extensão de loop D (DLE) utilizam o princípio da ligadura de proximidade juntamente com a PCR quantitativa para quantificar a formação de D-loop, a extensão de D-loop e a formação de produtos no local de uma ruptura induzível de fita dupla em Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Os danos ao DNA, incluindo quebras de fita dupla do DNA e ligações cruzadas entre fitas, incorridos durante as fases S e G2 do ciclo celular podem ser reparados por recombinação homóloga (HR). Além disso, o RH representa um importante mecanismo de resgate de fork de replicação após estol ou colapso. A regulação dos muitos passos reversíveis e irreversíveis desta complexa via promove a sua fidelidade. A análise física dos intermediários de recombinação formados durante a FC possibilita a caracterização desses controles por diversos fatores nucleoproteicos e seus interatores. Embora existam métodos bem estabelecidos para testar eventos específicos e intermediários na via de recombinação, a detecção de formação e extensão de alça D, duas etapas críticas nessa via, provou ser desafiadora até recentemente. Aqui, métodos eficientes para detectar eventos-chave na via HR, ou seja, formação de quebra de fita dupla de DNA, formação de alça D, extensão de alça D e formação de produtos via replicação induzida por quebra (BIR) em Saccharomyces cerevisiae são descritos . Esses ensaios detectam seus intermediários de recombinação relevantes e produtos com alta sensibilidade e são independentes da viabilidade celular. A detecção de D-loops, extensão D-loop e o produto BIR é baseada na ligadura de proximidade. Juntos, esses ensaios permitem o estudo da cinética da FC no nível da população para abordar finamente as funções das proteínas e reguladores da FC em etapas significativas na via.
Introduction
A recombinação homóloga (FC) é um mecanismo de alta fidelidade de reparo de quebras de fita dupla (DSBs) de DNA, ligações cruzadas entre fitas e lacunas de ssDNA, bem como um caminho para a tolerância a danos ao DNA. A FC difere das vias propensas a erros para reparo/tolerância a danos no DNA, como a junção final não homóloga (NHEJ) e a síntese translesão, na medida em que utiliza um DNA duplex homólogo intacto como doador para modelar o evento de reparo. Além disso, muitos dos principais intermediários na via da FC são reversíveis, permitindo uma regulação requintada das etapas individuais da via. Durante as fases S, G2 e M do ciclo celular, a HR compete com a NHEJ pelo reparo dos DSBs 1 de duasextremidades. Além disso, a FC é essencial para a replicação do DNA para o reparo de danos ao DNA associados à replicação, incluindo lacunas de ssDNA e DSBs unilaterais, e como um mecanismo de bypass de lesão de DNA2.
Um intermediário crítico na via HR é o loop de deslocamento, ou D-loop (Figura 1). Após a ressecção final, a recombinase central na reação, Rad51, carrega no ssDNA recém-ressecado da molécula quebrada, formando um filamento helicoidal2. Rad51 então realiza uma pesquisa de homologia para identificar um doador homólogo adequado, tipicamente a cromátide irmã em células somáticas. A alça D é formada quando o filamento Rad51-ssDNA invade um DNA duplex homólogo, o que leva ao emparelhamento de bases Watson-Crick da fita quebrada com a fita complementar do doador, deslocando a fita doadora oposta. A extensão da extremidade 3′ da fita quebrada por uma DNA polimerase substitui as bases que foram perdidas durante o evento de dano ao DNA e promove a resolução do intermediário estendido D-loop em um produto dsDNA através do recozimento de fita dependente de síntese (SDSA), da junção de Holliday duplo (dHJ) ou das subvias HR de replicação induzida por quebra (BIR).
Ensaios que monitoram fisicamente os intermediários na via de FC permitem a análise dos requisitos genéticos para cada etapa (ou seja, análise de via). A formação de DSB, ressecção final, dHJs, bolhas de replicação BIR e produtos HR são prontamente observados pelo Southern blotting 3,4,5,6,7. No entanto, o Southern blotting não relata alças D nascentes e estendidas e, portanto, é necessário um método alternativo para medir de forma confiável essas moléculas articulares 4,8,9. Uma estratégia amplamente utilizada para analisar a formação nascente de alça D é a imunoprecipitação de cromatina (ChIP) de Rad51 juntamente com a PCR quantitativa (qPCR)10,11. Entretanto, a associação de Rad51 com dsDNA medida por ChIP-qPCR é independente da homologia de sequência e do fator acessório Rad51 Rad5410,11. Em contraste, um sinal apreciável usando o método de análise de loop D aqui apresentado, chamado de ensaio de captura de loop D (DLC), depende da formação de DSB, homologia de sequência, Rad51 e das proteínas acessórias Rad51 Rad52 e Rad548. O achado de que a formação de D-loop promovida por Saccharomyces cerevisiae Rad51 depende do Rad54 in vivo está de acordo com numerosos experimentos de reconstituição in vitro, indicando que o Rad54 é necessário para a busca de homologia e a formação de alça D pela levedura Rad51 8,12,13,14,15.
As abordagens atuais para medir a extensão do D-loop, principalmente por meio de PCR semiquantitativa, são igualmente problemáticas. Um ensaio típico baseado em PCR para detectar a extensão da alça D amplifica uma sequência única, resultante da recombinação entre um local de ruptura e um doador ectópico e a subsequente síntese de DNA associada à recombinação, através de um primer a montante da região de homologia na fita quebrada e outro primer a jusante da região de homologia na cadeia doadora. Utilizando esse método, a detecção da síntese de DNA associada à recombinação requer o fator de processividade não essencial Pol δ Pol3216. Esse achado entra em conflito com a observação de que a deleção do POL32 tem apenas um efeito leve na conversão gênica in vivo17. Além disso, esses ensaios baseados em PCR não conseguem resolver temporalmente a extensão da alça D e a formação de produtos BIR, sugerindo que o sinal resulta de produtos de dsDNA e não de intermediários de ssDNA17,18,19. O ensaio de extensão D-loop (DLE) foi recentemente desenvolvido para abordar essas discrepâncias. O ensaio DLE quantifica a síntese de DNA associada à recombinação em um local ~ 400 pares de bases (pb) a jusante do final inicial de 3′ invasor9. Por este método, a extensão D-loop é independente do Pol32 e é detectável dentro de 4 h após a indução DSB, enquanto os produtos BIR são observados pela primeira vez às 6 h. De fato, uma publicação recente dos laboratórios Haber e Malkova observou que o uso desse método de preparação de DNA genômico resulta singularmente na preservação do ssDNA 9,20.
Aqui, os ensaios DLC e DLE são descritos em detalhes. Esses ensaios dependem da ligadura de proximidade para detectar alças D nascentes e estendidas em S. cerevisiae (Figura 2)8,9. Os produtos BIR podem ser quantificados usando este mesmo sistema de ensaio. Para ambos os ensaios, a formação de DSB em um local de corte de endonuclease HO localizado no locus URA3 no cromossomo (Chr.) V é induzida pela expressão da endonuclease HO sob o controle de um promotor induzível por galactose. A invasão da cadeia de DNA mediada por Rad51 leva à formação nascente de alça D no local de um doador ectópico localizado no locus LYS2 em Chr. II. Como o lado direito do DSB não tem homologia com o doador, o reparo via formação de SDSA e dHJ não é viável. O reparo inicial do DSB por BIR é possível, mas a formação de produtos viáveis é inibida pela presença do centrômero21. Esse projeto deliberado impede o reparo produtivo do DSB, evitando assim a retomada do crescimento por células com DBSs reparados, que de outra forma poderiam ultrapassar a cultura durante a análise do curso de tempo.
No ensaio DLC, a reticulação psoralênica das duas cadeias do DNA heteroduplex dentro da alça D preserva o intermediário de recombinação. Após a restauração do sítio enzimático de restrição na fita quebrada (ressecada) e digestão, a reticulação permite a ligadura das sequências únicas a montante dos DNAs homólogos quebrados e doadores. Usando qPCR, o nível de molécula de DNA quimérico presente em cada amostra é quantificado. No ensaio DLE, a reticulação não é necessária, e a restauração e digestão do sítio da enzima de restrição, seguidas de ligadura intramolecular, ligam a extremidade 5′ da molécula quebrada à extremidade 3′ recém-estendida. Novamente, qPCR é usado para quantificar as quantidades relativas deste produto quimérico em cada amostra. Na ausência de restauração do sítio da enzima de restrição, o ensaio DLE relata os níveis relativos do produto BIR (dsDNA) que é formado após a extensão da alça D.
Resultados representativos para cada ensaio utilizando uma cepa do tipo selvagem são mostrados, e os leitores são encaminhados para Piazza et al.8 e Piazza et al.9 para o uso desses ensaios para a análise de mutantes de recombinação 8,9. A intenção desta contribuição é permitir que outros laboratórios adotem os ensaios DLC e DLE, e o suporte para eles está disponível mediante solicitação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os ensaios apresentados permitem a detecção de alças D nascentes e estendidas (ensaio DLC), extensão D-loop (ensaio DLE) e formação de produtos BIR (ensaio DLE sem oligonucleotídeos hibridizantes) usando ligadura de proximidade e qPCR. O ChIP-qPCR do Rad51 para locais distantes do DSB já foi usado anteriormente como proxy para a busca de homologia mediada pelo Rad51 e a formação de D-loop. No entanto, esse sinal ChIP-qPCR é independente da homologia de sequência entre o local de ruptura e um potencial doador,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho no laboratório Heyer é apoiado pelas subvenções GM58015 e GM137751 a W.-D.H. A investigação no laboratório Piazza é apoiada pelo Conselho Europeu de Investigação (ERC-StG 3D-loop, grande acordo 851006). A D.R. é apoiada pelo T32CA108459 e pela Fundação A.P. Giannini. Agradecemos a Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) por compartilhar seus resultados de ensaio DLC / DLE e por validar adicionalmente as alterações nos ensaios que são detalhadas neste protocolo.
Materials
| 1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection | |||
| Equipment | |||
| 15 and 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL glass culture tubes | |||
| 250 mL, 500 mL, or 1 L flasks | |||
| 60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom | Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G | ||
| Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters | |||
| Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver | |||
| Rotator | |||
| UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker | Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831 | ||
| Materials | |||
| 60% w/w sodium DL-lactate syrup | Sigma-Aldrich | L1375 | For media preparation |
| Agar | Fisher | BP1423500 | For media preparation |
| Bacto peptone | BD Difco | 211840 | For media preparation |
| Bacto yeast extract | BD Difco | 212750 | For media preparation |
| D-(+)-glucose | BD Difco | 0155-17-4 | For media preparation |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | For psoralen cross-linking |
| 2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration | |||
| Supplies | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Dry bath | |||
| Liquid nitrogen or dry ice/ethanol | |||
| Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge | |||
| Materials | |||
| 10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | For spheroplasting |
| 3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation | |||
| Supplies | |||
| Water bath | |||
| Materials | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | Restriction enzyme digest for DLC assay |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104 | Restriction enzyme digest for DLE assay |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Intramolecular ligation |
| 4. DNA purification | |||
| Supplies | |||
| 1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| Materials | |||
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA purification |
| 5. Psoralen cross-link reversal | |||
| Supplies | |||
| Thermocycler/PCR machine | |||
| 6. qPCR | |||
| Supplies | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | qPCR machine used by the authors |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR machine used by the authors |
| Materials | |||
| LightCycler 480 96-Well Plate, white | Roche | 4729692001 | 96-well plates for qPCR |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | qPCR kit used by the authors |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | qPCR kit used by the authors |
References
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