Påvisning av homologe rekombinasjonsmellomprodukter via nærhetsligering og kvantitativ PCR i Saccharomyces cerevisiae
Summary
D-loop capture (DLC) og D-loop extension (DLE) analysene benytter prinsippet om nærhetsligering sammen med kvantitativ PCR for å kvantifisere D-loop-formasjon, D-loop-utvidelse og produktdannelse på stedet for et induserbart dobbeltstrenget brudd i Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
DNA-skade, inkludert DNA-dobbeltstrengede brudd og kryssbindinger mellom tråder, pådratt under S- og G2-fasene av cellesyklusen, kan repareres ved homolog rekombinasjon (HR). I tillegg representerer HR en viktig mekanisme for replikasjonsgaffelredning etter stalling eller kollaps. Reguleringen av de mange reversible og irreversible trinnene i denne komplekse veien fremmer dens troskap. Den fysiske analysen av rekombinasjonsmellomproduktene dannet under HR muliggjør karakterisering av disse kontrollene av forskjellige nukleoproteinfaktorer og deres interaksjoner. Selv om det er veletablerte metoder for å analysere spesifikke hendelser og mellomprodukter i rekombinasjonsbanen, har deteksjonen av D-loop-dannelse og forlengelse, to kritiske trinn i denne banen, vist seg utfordrende inntil nylig. Her beskrives effektive metoder for å oppdage nøkkelhendelser i HR-banen, nemlig DNA-dobbeltstrenget brudddannelse, D-sløyfedannelse, D-sløyfeforlengelse og dannelse av produkter via bruddindusert replikasjon (BIR) i Saccharomyces cerevisiae . Disse analysene oppdager deres relevante rekombinasjonsforbindelser og produkter med høy følsomhet og er uavhengige av cellulær levedyktighet. Påvisning av D-sløyfer, D-sløyfeforlengelse og BIR-produktet er basert på nærhetsligering. Sammen gjør disse analysene det mulig å studere kinetikken til HR på befolkningsnivå for å finadressere funksjonene til HR-proteiner og regulatorer på betydelige trinn i banen.
Introduction
Homolog rekombinasjon (HR) er en hi-fi-mekanisme for reparasjon av DNA-dobbeltstrengede brudd (DSB), tverrbindinger mellom tråder og ssDNA-hull, samt en vei for DNA-skadetoleranse. HR skiller seg fra feilutsatte veier for reparasjon/toleranse av DNA-skader, slik som ikke-homolog endesammenføyning (NHEJ) og translesjonssyntese, ved at den benytter et intakt, homologt dupleks DNA som donor for å mal reparasjonshendelsen. Videre er mange av de viktigste mellomleddene i HR-banen reversible, noe som muliggjør utsøkt regulering av de enkelte veitrinnene. Under S-, G2- og M-fasene i cellesyklusen konkurrerer HR med NHEJ om reparasjon av de to-endede DSB-ene1. I tillegg er HR avgjørende for DNA-replikasjon for reparasjon av replikasjonsassosiert DNA-skade, inkludert ssDNA-hull og ensidige DSB-er, og som en mekanisme for DNA-lesjon bypass2.
Et kritisk mellomprodukt i HR-banen er forskyvningssløyfen, eller D-sløyfen (figur 1). Etter endereseksjon laster den sentrale rekombinasen i reaksjonen, Rad51, på det nylig resekterte ssDNA av det ødelagte molekylet, og danner et spiralformet filament2. Rad51 utfører deretter et homologisøk for å identifisere en egnet homolog donor, typisk søsterkromatiden i somatiske celler. D-sløyfen dannes når Rad51-ssDNA-filamentet invaderer et homologt dupleks DNA, noe som fører til Watson-Crick-baseparingen av den ødelagte strengen med donorens komplementære streng, og fortrenger den motsatte donorstrengen. Forlengelse av 3′-enden av den ødelagte strengen av en DNA-polymerase erstatter basene som gikk tapt under DNA-skadehendelsen og fremmer oppløsning av det utvidede D-loop-mellomproduktet til et dsDNA-produkt gjennom synteseavhengig strandglødning (SDSA), dobbelt-Holliday-krysset (dHJ) eller break-induced replication (BIR) HR-underveier.
Analyser som fysisk overvåker mellomproduktene i HR-banen, tillater analyse av de genetiske kravene for hvert trinn (dvs. veianalyse). DSB-dannelse, endereseksjon, dHJ-er, BIR-replikasjonsbobler og HR-produkter observeres lett av Southern blotting 3,4,5,6,7. Likevel unnlater Southern blotting å rapportere om begynnende og utvidede D-løkker, og dermed er det nødvendig med en alternativ metode for pålitelig måling av disse leddmolekylene 4,8,9. En mye brukt strategi for å analysere begynnende D-sløyfedannelse er kromatin-immunoprecipitation (ChIP) av Rad51 kombinert med kvantitativ PCR (qPCR) 10,11. Rad51-assosiasjonen med dsDNA målt ved ChIP-qPCR er imidlertid uavhengig av sekvenshomologi og Rad51-tilbehørsfaktoren Rad5410,11. I motsetning til dette avhenger et betydelig signal ved hjelp av metoden for D-loop-analyse som presenteres her, kalt D-loop capture (DLC) -analysen, av DSB-formasjon, sekvens homologi, Rad51 og Rad51-tilbehørsproteinene Rad52 og Rad548. Funnet om at Saccharomyces cerevisiae Rad51-fremmet D-sløyfedannelse avhenger av Rad54 in vivo er i samsvar med mange in vitro rekonstitueringseksperimenter som indikerer at Rad54 er nødvendig for homologisøk og D-sløyfedannelse ved spirende gjær Rad51 8,12,13,14,15.
Nåværende tilnærminger til måling av D-loop-forlengelse, først og fremst gjennom semi-kvantitativ PCR, er tilsvarende problematiske. En typisk PCR-basert analyse for å oppdage D-loop-utvidelse forsterker en unik sekvens, som følge av rekombinasjon mellom et pausested og en ektopisk donor og den påfølgende rekombinasjonsassosierte DNA-syntesen, via en primer oppstrøms homologiområdet på den ødelagte strengen og en annen primer nedstrøms for homologiområdet på donorstrengen. Ved hjelp av denne metoden krever deteksjon av rekombinasjonsassosiert DNA-syntese den ikke-essensielle Pol δ prosessivitetsfaktoren Pol3216. Dette funnet er i konflikt med observasjonen om at POL32-delesjon bare har en mild effekt på genkonvertering in vivo17. Videre klarer ikke disse PCR-baserte analysene å midlertidig løse D-loop-utvidelse og BIR-produktdannelse, noe som tyder på at signalresultatene fra dsDNA-produkter i stedet for ssDNA mellomprodukter17,18,19. D-loop extension (DLE) -analysen ble nylig utviklet for å løse disse avvikene. DLE-analysen kvantifiserer rekombinasjonsassosiert DNA-syntese på et sted ~ 400 basepar (bp) nedstrøms for den første 3 ‘invaderende enden9. Ved denne metoden er D-loop-forlengelse uavhengig av Pol32 og kan påvises innen 4 timer etter DSB-induksjon, mens BIR-produkter først observeres ved 6 timer. Faktisk bemerket en nylig publikasjon fra Haber- og Malkova-laboratoriene at bruk av denne metoden for fremstilling av genomisk DNA enkeltvis resulterer i ssDNA-bevaring 9,20.
Her er DLC- og DLE-analysene beskrevet i detalj. Disse analysene er avhengige av nærhetsligering for å oppdage begynnende og utvidede D-løkker i S. cerevisiae (figur 2)8,9. BIR-produkter kan kvantifiseres ved hjelp av det samme analysesystemet. For begge analysene er DSB-dannelse på et HO-endonuklease-kuttsted lokalisert ved URA3-lokuset på kromosom (Chr.) V indusert av ekspresjonen av HO-endonukleasen under kontroll av en galaktoseinduserbar promotor. Rad51-mediert DNA-strenginvasjon fører til begynnende D-sløyfedannelse på stedet for en ektopisk donor lokalisert ved LYS2-lokuset på Chr. II. Siden høyre side av DSB mangler homologi til giveren, er reparasjon via SDSA- og dHJ-dannelse ikke mulig. Første reparasjon av DSB av BIR er mulig, men dannelsen av levedyktige produkter hemmes av tilstedeværelsen av sentromere21. Denne bevisste utformingen forhindrer produktiv DSB-reparasjon, og unngår dermed gjenopptakelse av vekst av celler med reparerte DBS-er, som ellers kan overta kulturen i løpet av tidsforløpsanalysen.
I DLC-analysen bevarer psoralen tverrbinding av de to strengene av heteroduplex DNA i D-sløyfen rekombinasjonsmiddelet. Etter restaurering av restriksjonsenzymstedet på den ødelagte (resekterte) strengen og fordøyelsen, tillater tverrbindingen ligering av de unike sekvensene oppstrøms for homologe ødelagte og donor-DNAer. Ved hjelp av qPCR kvantifiseres nivået av kimært DNA-molekyl tilstede i hver prøve. I DLE-analysen er det ikke nødvendig med tverrbinding, og restaurering og fordøyelse av restriksjonsenzymstedet etterfulgt av intramolekylær ligering knytter i stedet 5′-enden av det ødelagte molekylet til den nylig utvidede 3′-enden. Igjen brukes qPCR til å kvantifisere de relative mengdene av dette kimære produktet i hver prøve. I fravær av restaurering av restriksjonsenzymstedet, rapporterer DLE-analysen om de relative nivåene av BIR (dsDNA)-produktet som dannes etter D-loop-utvidelsen.
Representative resultater for hver analyse ved bruk av en villtypestamme vises, og leserne henvises til Piazza et al.8 og Piazza et al.9 for bruk av disse analysene for analyse av rekombinasjonsmutanter 8,9. Hensikten med dette bidraget er å gjøre det mulig for andre laboratorier å ta i bruk DLC- og DLE-analysene, og støtte for dem er tilgjengelig på forespørsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analysene som presenteres tillater deteksjon av begynnende og utvidede D-sløyfer (DLC-analyse), D-loop-utvidelse (DLE-analyse) og BIR-produktdannelse (DLE-analyse uten hybridisering av oligonukleotider) ved bruk av nærhetsligering og qPCR. ChIP-qPCR av Rad51 til steder fjernt fra DSB har tidligere blitt brukt som en proxy for Rad51-mediert homologisøk og D-loop-formasjon. Imidlertid er dette ChIP-qPCR-signalet uavhengig av sekvenshomologien mellom pausestedet og en potensiell donor, så vel som den Rad51-assosierte fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet i Heyer-laboratoriet støttes av bevilgningene GM58015 og GM137751 til W.-D.H. Forskning på Piazza-laboratoriet er støttet av Det europeiske forskningsrådet (ERC-StG 3D-loop, stor avtale 851006). D.R. støttes av T32CA108459 og A.P. Giannini Foundation. Vi takker Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) for å dele sine DLC / DLE-analyseresultater og for i tillegg å validere endringene i analysene som er beskrevet i denne protokollen.
Materials
| 1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection | |||
| Equipment | |||
| 15 and 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL glass culture tubes | |||
| 250 mL, 500 mL, or 1 L flasks | |||
| 60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom | Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G | ||
| Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters | |||
| Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver | |||
| Rotator | |||
| UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker | Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831 | ||
| Materials | |||
| 60% w/w sodium DL-lactate syrup | Sigma-Aldrich | L1375 | For media preparation |
| Agar | Fisher | BP1423500 | For media preparation |
| Bacto peptone | BD Difco | 211840 | For media preparation |
| Bacto yeast extract | BD Difco | 212750 | For media preparation |
| D-(+)-glucose | BD Difco | 0155-17-4 | For media preparation |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | For psoralen cross-linking |
| 2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration | |||
| Supplies | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Dry bath | |||
| Liquid nitrogen or dry ice/ethanol | |||
| Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge | |||
| Materials | |||
| 10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | For spheroplasting |
| 3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation | |||
| Supplies | |||
| Water bath | |||
| Materials | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | Restriction enzyme digest for DLC assay |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104 | Restriction enzyme digest for DLE assay |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Intramolecular ligation |
| 4. DNA purification | |||
| Supplies | |||
| 1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| Materials | |||
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA purification |
| 5. Psoralen cross-link reversal | |||
| Supplies | |||
| Thermocycler/PCR machine | |||
| 6. qPCR | |||
| Supplies | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | qPCR machine used by the authors |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR machine used by the authors |
| Materials | |||
| LightCycler 480 96-Well Plate, white | Roche | 4729692001 | 96-well plates for qPCR |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | qPCR kit used by the authors |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | qPCR kit used by the authors |
References
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
- Heyer, W. -. D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).
- Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
- Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
- Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
- Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
- Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
- Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
- Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -. D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
- Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
- Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
- Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
- Wright, W. D., Heyer, W. -. D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
- Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -. D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058 (2019).
- Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
- Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
- Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
- Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
- Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
- Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
- Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847 (2021).
- Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
- Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
- Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
- Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
- Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195 (2017).
- Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -. D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
- Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -. D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111 (2020).
