Her præsenterer vi en protokol til optisk detektion i høj opløsning af kemisk information omkring implanteret medicinsk udstyr med røntgenexciteret luminescens kemisk billeddannelse (XELCI). Denne nye billeddannelsesteknik er udviklet i vores laboratorium, som gør det muligt at studere implantatassocieret infektionsbiokemi.
Mikrobielle infektioner forbundet med implanterbart medicinsk udstyr er et stort problem ved frakturfikseringsfejl. Tidlig diagnose af en sådan infektion vil muliggøre en vellykket udryddelse med antibiotika uden ekstra omkostninger til en anden operation. Heri beskriver vi XELCI som en teknik med høj røntgenopløsning, implantatspecificitet og kemisk følsomhed over for ikke-invasivt billedkemiske koncentrationer nær overfladen af implanteret medicinsk udstyr. Enhederne er belagt med kemisk rapporterende overflader. Denne kemisk responsive overflade består af to lag belagt med et implanterbart medicinsk udstyr; et pH-følsomt lag (bromthymolblåt eller bromocresolgrønt inkorporeret hydrogel), som er belagt over et rødt lys-scintillator (Gd2O2S: Eu) lag til overvågning. En fokuseret røntgenstråle bestråler et sted på implantatet, og det røde lys, der genereres af scintillator (med 620 nm og 700 nm toppe) transmitteres gennem sensorlaget, som ændrer spektralforholdet afhængigt af pH. Et billede genereres ved at scanne røntgenstrålen over implantatet og måle spektralforholdet mellem lys, der passerer gennem vævet punkt for punkt. Vi brugte denne billeddannelsesteknik til overvågning af implantatassocierede infektioner, der tidligere var på lårbenets knogleoverflade med en modificeret implanterbar pladesensor. Nu studerer vi pH-ændringer, der opstår fra tibiale intramedullære stanginfektioner. To forskellige typer intramedullære stangdesign anvendes i kaninstudier før pilot, og vi lærte, at XELCI-teknikken kunne bruges til at overvåge eventuelle kemiske ændringer, der ikke kun forekommer på knogleoverfladen, men også inde i knoglen. Dette muliggør således ikke-invasiv, høj rumlig opløsning, lokal pH-billeddannelse med lav baggrund til at studere implantatassocieret infektionsbiokemi.
I USA indsættes ca. 2 millioner frakturfikseringsanordninger årligt, og 5% -10% af dem fører til implantatassocierede infektioner1. Disse infektioner er sværere at behandle med antibiotika på senere stadier på grund af biofilmenes heterogenitet og antibiotikaresistente karakter 2,3. Hvis de diagnosticeres tidligt, kan infektioner behandles med antibiotika og kirurgisk debridering for at forhindre ekstra medicinske omkostninger til en anden operation for at erstatte hardware på det behandlede brudsted. Almindelig radiografi og andre avancerede radiografiske teknikker anvendes til diagnosticering af ortopædiske implantatassocierede infektioner, ikke-fagforeninger og relaterede komplikationer. Selvom disse teknikker ofte bruges til at erhverve strukturel information om den omgivende knogle og væv ved det ortopædiske implantat, er de ikke i stand til at give biokemisk information i det specifikke miljø. Derfor udviklede vi en ny XELCI-teknik (X-ray Excited Luminescence Chemical Imaged) til billeddannelse i høj opløsning af biokemisk information noninvasivt på implantatstedet. Diagnose af ortopædiske implantatassocierede infektioner udføres almindeligvis på en eller en kombination af forskellige måder. Kliniske observationer (smerte, hævelse, rødme, sårudflåd osv.) tyder på de første tegn på infektion. Senere udføres radiologiske og laboratorieforsøg for at bekræfte svigt i knoglehelingsprogression og identificere patogenorganismen 4,5. Nukleære medicinske teknikker såsom computertomografi (CT), magnetisk resonansbilleddannelse (MR) og radionukleotidmetoder såsom Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) og Positron Emission Tomography (PET) er i brug til bedre visualisering af det inficerede implantat og den tilhørende infektion 6,7. CT og MR er fordelagtige til bestemmelse af henholdsvis knoglenekrose og abnormiteter i blødt væv, men forårsager interferens tæt på metalimplantaterne8. Forskellige røntgenmetoder såsom SPECT og PET i kombination med radioisotopmærkede analysander som in vivo-billeddannende kontrastmidler anvendes i vid udstrækning til at diagnosticere implantatassocieret osteomyelitis2. Nuværende applikationer kombinerer både data fra CT-scanning og mærkningsdata fra enten SPECT eller PET for at generere anatomisk information9. Selvom en eller flere af disse billeddannelsesmetoder bruges til at hjælpe infektionsdiagnosen, kan de ikke opdage pH-variationerne forbundet med infektion tidligt for at starte behandlingerne med antibiotika for at undgå ekstra medicinske og kirurgiske udgifter.
Den største fordel ved at udnytte billeddannelsessystemet, der anvendes i denne undersøgelse til overvågning af implantatassocierede infektioner, er dets evne til at afsløre biokemisk information om biofilmmikromiljøet med en spektral reference. Selvom hovedfokus er på billeddannelse og kortlægning af pH på det inficerede sted, kan denne metode ændres til at overvåge andre biomarkører, der er specifikke for implantatassocierede infektioner. Således tillader XELCI forståelse af infektionens patofysiologi. Den høje rumlige opløsning billeddannelse tillader kortlægning heterogenitet, når infektionen vokser. pH på overfladen, hvor biofilmdannelsen finder sted, er meget vigtig for at forstå biokemiske ændringer. Andre mikromiljøændringer kan også forekomme på grund af antibiotikarelaterede stressresponser fra bakterier10,11. På grund af overfladespecifik billeddannelse med høj rumlig opløsning kan antibiotikaeffekten på biofilmmikromiljøet overvåges. Teknikken kan også bruges til at studere biofilmmiljøet til målrettede lægemiddelleveringseksperimenter. Vi kan studere målrettet frigivelse af lægemidler med lav pH-værdi eller hæve pH-værdien for at gøre dem mere modtagelige for at arbejde ved højere pH-værdi.
Tre specifikke egenskaber ved denne billeddannelsesteknik er røntgenopløsning, implantatoverfladespecificitet og kemisk følsomhed (figur 1A). Disse egenskaber kan sammenlignes med de aktuelt tilgængelige billeddannelsesteknikker til billeddannelse af ortopædiske implantatrelaterede infektioner (figur 1B). Når fosforpartiklerne er bestrålet med røntgenstråler, genererer de rødt og nær-IR (NIR) lys, der kan trænge igennem nogle få centimeter væv (omend med en vis dæmpning)12,13. Tabel 1 viser nogle af funktionerne i det udviklede billeddannelsessystem sammenlignet med andre måder, der er blevet brugt til at måle pH i biofilm eller gennem væv.
XELCI er en ny billeddannelsesteknik til optisk at erhverve kemisk information med høj rumlig opløsning nær implanteret medicinsk udstyr i kombination med røntgenexcitation, som vist i figur 2. Her anvendes selektiv excitation og optisk detektion af røntgenexcitable fosforpartikler. Implantatet er belagt med to lag, et pH-følsomt farvestof, inkorporeret polymerlag over et lag af scintillator partikler. Når en sekvens af fokuserede røntgenstråler bestråler implantatet, genererer scintillatorlaget synligt lys (620 nm og 700 nm). Dette producerede lys passerer gennem det pH-følsomme lag, der modulerer luminescensspektret afhængigt af pH i det omgivende miljø. Lav pH er generelt forbundet med infektion og biofilmdannelse; efterhånden som infektionen skrider frem, ændres pH-værdien fra fysiologisk pH (pH 7,2) til sur (mindre end pH 7), og pH-farvestoffet i sensoren skifter farve og dermed absorbans. Variationen af luminescensspektret er vist i figur 2E for bromocresolgrønt pH-farvestof ved pH 7 og pH 4. Det transmitterede lys gennem væv og knogle opsamles, og spektralforholdet bestemmer pH. For at generere et pH-billede bestråler den fokuserede røntgenstråle et punkt ad gangen i scintillatorfilmen og scanner strålen punkt for punkt over prøven. Tidligere blev denne teknik anvendt til billed pH-variation på overfladen af de ortopædiske implantater14,15 og har testet den til at overvåge pH-variationer i den intramedullære kanal gennem knogler og væv.
Figur 3 nedenfor viser et skema over billeddannelsessystemet. Grundlæggende komponenter i billeddannelsessystemet er røntgenexcitationskilden med polykapillær optik, en akryllysguide i ét stykke, der forbinder to fotomultiplikatorrør, x, y og z motoriseret trin (30 cm x 15 cm x 6 cm vandring) og computeren tilsluttet til dataindsamling. Røntgenkilden, x, y, z-trinnet og opsamlingsoptikken (albue, lysguide, fotomultiplikatorrør (PMT’er)) er i røntgenbeviset kabinet, mens røntgencontrolleren, strømkilden til PMT’er, funktionsgenerator, der er tilsluttet dataindsamlingskortet (DAQ) og computeren, holdes udenfor. En trykknap, normalt åben kontakt, placeret mellem kabinettet og dørens forside fungerer som en låsning. Hvis døren ikke er helt lukket (låsekontakten er åben), tændes røntgenkilden ikke, og den slukker automatisk røntgenkilden, hvis den åbnes under drift. Motorerne kan udføre en kontinuerlig scanning, såvel som de kan flyttes til ethvert diskret sted. Scanningshastigheden for y-aksen er normalt 1-5 mm/s, mens trinstørrelsen på x-aksen typisk kan vælges fra 150-2000 μm. Parametrene kan vælges afhængigt af den krævede rumlige opløsning. Selv eksponeringstider bekræftes af ensartet hastighed gennem en kontinuerlig scanning.
Når den fokuserede røntgenstråle er bestrålet på røntgenluminescenspartiklerne, vil det genererede lys passere gennem den pH-følsomme film ved at modulere lyset afhængigt af den omgivende pH. Det transmitterede lys vil interagere (sprede og absorbere delvist) med et væv, mens lysdæmpningen ved spredning og absorption øges, når vævstykkelsen øges. Kollektionsoptikken inkluderer en todelt akryllysguide i ét stykke udstyret med en reflekterende aluminiumsalbue (med en 90 ° bøjning og poleret reflekterende indvendig overflade) i begyndelsen. Dette er for at sikre, at lyset kolliderer, så snart lyset når lysguiden. Disse tilføjelser forbedrede lysindsamlingseffektiviteten betydeligt. For yderligere detaljer viser figur 4 maskintegningerne af albuen og lysstyret. 90 ° albuen blev bearbejdet af aluminium med den indvendige overflade poleret til en spejlfinish, og lysstyret blev bearbejdet med akryl. Vi har også monteret et bredt udvalg af langpasblåt lysfilter (blokerer 350-450 nm lys) i begyndelsen af albuen for at sikre, at kun rødt lys passerer igennem. Enden af akryllysføringen i ét stykke deler sig i to strømme, der fører til to forskellige PMT’er. PMT’erne er lukket i en lille lystæt metalkasse, der er i kontakt med en termoelektrisk køler for at køle PMT’erne ned til ~ 5 ° C. I begyndelsen af en af PMT’erne er et langpasfilter med smal rækkevidde (blokering af 570-640 nm lys og passerer 640-740 nm lys) fastgjort til kun at måle 700 nm lyset. Derfor kan 620 nm og 700 nm lyset beregnes separat. PMT’erne er sat op i fotontællingstilstand, og de genererer transistor-transistorlogik (TTL) impulser for hver detekteret foton. Et DAQ-system tæller impulserne (mætningspunkt 20 millioner impulser pr. sekund) ved hjælp af USB-kommunikation. To separate intensitetskort genereres efter behandling af dataene, og et endeligt billede oprettes ved at overveje forholdet mellem signalbølgelængdeintensiteten (620 nm) og referencebølgelængdeintensiteten (700 nm). Dette forhold tegner sig for forskelle i total lysindsamlingseffektivitet, som i høj grad afhænger af opsamlingsoptikkens position, røntgenbestrålingsintensitet og vævstykkelse. Derudover tegner et rumligt adskilt referenceområde uden noget pH-indikatorfarvestof sig for spektral forvrængning fra bølgelængdeafhængig vævsindtrængning. Et grafikbaseret programmeringssprog bruges til styring af billedbehandlingssystemet, og et grundlæggende rutediagram over operationen er vist nedenfor. Billeddannelsesopsætningen, bortset fra computeren, røntgencontrolleren og DAQ-enheden, er lukket i et sikkert røntgenkabinet for at minimere strålingseksponering.
For at kunne opdage og studere ortopædiske implantatassocierede infektioner tidligt for at undgå komplikationer fra osteomyelitis og sekundære kirurgiske procedurer har vi introduceret XELCI som en ny, funktionel billeddannelsesteknik. Det kan sammenlignes med de aktuelt tilgængelige teknikker til pH-overvågning gennem væv.
Mens vi placerer prøven til billeddannelse, bruger vi et lasertværhoved forbundet til polykapillær fokuseringsoptik med to skærende linjeformede laserpegepinde i …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Clemson University, COMSET og Clemson SC BioCRAFT. XELCI-opsætningen blev oprindeligt udviklet med midler fra NSF CAREER CHE 12255535 og senere af NIH NIAMS R01 AR070305-01.
90 degree elbow | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
Bromo Cresol Green | Sigma-Aldrich | 45ZW10 | |
Bromo Thymol Blue | Sigma | 76-59-5 | |
ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate | Pollock industries, White River, VT, USA | TCP 50 | |
Ethanol | Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051 |
64-17-5 | |
Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm | Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England | UKL63/N-R1 | |
LabVIEW | National Instruments, Austin, TX | ||
Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis) | Motion Control, Smithtown, NY, USA | AT10-60 | |
National instruments c-DAQ 9171 | National Instruments, Austin, TX | NI cDAQ™-9171 | |
One piece acrylic light guide | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
pH 4 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5024 | |
pH 8 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5060 | |
Phosphate Buffer Solution | MP Biomedicals, Irvine, CA. USA | 2810305 | |
Photo multiplier tubes Model P25PC-16 | SensTech, Surrey, UK | Model P25PC-16 | |
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ATCC 25923 | |
Tryptic Soy Agar | Teknova, Hollister, CA, USA | T0520 | |
Tryptic Soy Broth | EMD Millipore, Burlington, MA, USA | 1005255000 | |
X-ray source-iMOXS | Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany | ||
X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel | Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA | LTS300 and LTS150 |