Chemische Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung von implantatassoziierten Infektionen mit röntgenangeregter Lumineszenz-chemischer Bildgebung durch Gewebe

Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur hochauflösenden optischen Detektion chemischer Informationen um implantierte medizinische Geräte mit röntgenangeregter lumineszenzchemischer Bildgebung (XELCI) vor. Dieses neuartige bildgebende Verfahren wird in unserem Labor entwickelt und ermöglicht die Untersuchung der Biochemie implantatassoziierter Infektionen.

Abstract

Mikrobielle Infektionen, die mit implantierbaren medizinischen Geräten in Verbindung gebracht werden, sind ein großes Problem für das Versagen der Frakturfixierung. Eine frühzeitige Diagnose einer solchen Infektion ermöglicht eine erfolgreiche Eradikation mit Antibiotika ohne zusätzliche Kosten für eine zweite Operation. In dieser Arbeit beschreiben wir XELCI als eine Technik mit hoher Röntgenauflösung, Implantatspezifität und chemischer Empfindlichkeit gegenüber nicht-invasiv abgebildeten chemischen Konzentrationen in der Nähe der Oberfläche implantierter medizinischer Geräte. Die Geräte sind mit chemisch berichtenden Oberflächen beschichtet. Diese chemisch ansprechende Oberfläche besteht aus zwei Schichten, die auf ein implantierbares medizinisches Gerät aufgetragen sind. eine pH-empfindliche Schicht (Bromthymolblau oder Bromkresolgrün eingearbeitetes Hydrogel), die zur Überwachung über eine rotlichtemittierende Szintillatorschicht (Gd2 O₂S: Eu) aufgetragen wird. Ein fokussierter Röntgenstrahl bestrahlt einen Punkt auf dem Implantat, und das vom Szintillator erzeugte rote Licht (mit 620 nm und 700 nm Peaks) wird durch die Sensorschicht übertragen, wodurch sich das spektrale Verhältnis je nach pH-Wert ändert. Ein Bild wird erzeugt, indem der Röntgenstrahl über das Implantat abgetastet und das spektrale Verhältnis des Lichts, das das Gewebe durchdringt, Punkt für Punkt gemessen wird. Wir nutzten dieses bildgebende Verfahren zur Überwachung von implantatassoziierten Infektionen, die zuvor auf der Knochenoberfläche des Femurs mit einem modifizierten implantierbaren Plattensensor aufgetreten waren. Jetzt untersuchen wir pH-Veränderungen, die durch Infektionen des Tibia-Markstäbchens auftreten. Zwei verschiedene Arten von Markstäben werden in Studien mit Kaninchen vor dem Pilotprojekt verwendet, und wir haben gelernt, dass die XELCI-Technik verwendet werden kann, um chemische Veränderungen zu überwachen, die nicht nur auf der Knochenoberfläche, sondern auch im Inneren des Knochens auftreten. Dies ermöglicht eine nicht-invasive Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung und niedrigem lokalen pH-Hintergrund, um die Biochemie implantatassoziierter Infektionen zu untersuchen.

Introduction

In den Vereinigten Staaten werden jährlich etwa 2 Millionen Frakturfixierungsgeräte eingesetzt, von denen 5 % bis 10 % zu implantatassoziierten Infektionen führen¹. Diese Infektionen sind in späteren Stadien aufgrund der Heterogenität und Antibiotikaresistenz der Biofilme schwieriger mit Antibiotika zu behandeln ^2,3. Wenn sie frühzeitig diagnostiziert werden, können Infektionen mit Antibiotika und chirurgischem Debridement behandelt werden, um zusätzliche medizinische Kosten für eine zweite Operation zu vermeiden, bei der die Hardware an der behandelten Frakturstelle ersetzt wird. Einfache Röntgenaufnahmen und andere fortschrittliche Röntgentechniken werden bei der Diagnose von orthopädischen Implantat-assoziierten Infektionen, Pseudarthrosen und damit verbundenen Komplikationen eingesetzt. Obwohl diese Techniken häufig verwendet werden, um strukturelle Informationen über den umgebenden Knochen und das umgebende Gewebe am orthopädischen Implantat zu erhalten, sind sie nicht in der Lage, biochemische Informationen in der spezifischen Umgebung zu liefern. Daher haben wir eine neuartige röntgenangeregte lumineszenzchemische Bildgebungstechnik (XELCI) entwickelt, mit der biochemische Informationen nicht-invasiv am Implantatort abgebildet werden können. Die Diagnostik von orthopädischen Implantat-assoziierten Infektionen erfolgt in der Regel mit einem oder einer Kombination verschiedener Methoden. Klinische Beobachtungen (Schmerzen, Schwellungen, Rötungen, Wundausfluss etc.) deuten auf erste Anzeichen einer Infektion hin. Später werden radiologische und labortechnische Experimente durchgeführt, um das Versagen der Knochenheilungsprogression zu bestätigen und den pathogenen Erreger zu identifizieren ^4,5. Zur besseren Darstellung des infizierten Implantats und der damit verbundenen Infektion werden nuklearmedizinische Verfahren wie Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT) und Radionukleotidmethoden wie die Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) und die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) eingesetzt ^6,7. CT und MRT sind vorteilhaft bei der Bestimmung von Knochennekrosen bzw. Weichteilanomalien, verursachen jedoch Interferenzen in geringem Abstand zu den Metallimplantaten⁸. Verschiedene Röntgenmethoden wie SPECT und PET in Kombination mit Radioisotopen-markierten Analyten als in vivo bildgebende Kontrastmittel werden häufig zur Diagnose der implantatassoziierten Osteomyelitis^{eingesetzt 2}. Aktuelle Anwendungen kombinieren sowohl Daten aus CT-Scans als auch Markierungsdaten aus SPECT oder PET, um anatomische Informationen zu generieren⁹. Obwohl eine oder mehrere dieser Bildgebungsmodalitäten zur Unterstützung der Infektionsdiagnose verwendet werden, können sie die mit der Infektion verbundenen pH-Schwankungen nicht frühzeitig erkennen, um die Behandlungen mit Antibiotika einzuleiten und zusätzliche medizinische und chirurgische Kosten zu vermeiden.

Der Hauptvorteil des in dieser Studie verwendeten Bildgebungssystems zur Überwachung implantatassoziierter Infektionen besteht darin, dass es biochemische Informationen über die Mikroumgebung des Biofilms mit einer spektralen Referenz aufdecken kann. Obwohl das Hauptaugenmerk auf der Bildgebung und Kartierung des pH-Werts an der infizierten Stelle liegt, kann diese Methode geändert werden, um andere Biomarker zu überwachen, die spezifisch für implantatassoziierte Infektionen sind. XELCI ermöglicht es somit, die Pathophysiologie der Infektion zu verstehen. Die hochauflösende Bildgebung ermöglicht es, die Heterogenität während des Wachstums der Infektion abzubilden. Der pH-Wert an der Oberfläche, an der die Biofilmbildung stattfindet, ist sehr wichtig für das Verständnis biochemischer Veränderungen. Auch andere Veränderungen der Mikroumgebung können aufgrund von antibiotikabedingten Stressreaktionen von Bakterien auftreten^10,11. Durch oberflächenspezifische und räumlich hochauflösende Bildgebung kann die antibiotische Wirkung auf die Biofilm-Mikroumgebung überwacht werden. Die Technik kann auch verwendet werden, um die Biofilmumgebung für gezielte Experimente zur Verabreichung von Medikamenten zu untersuchen. Wir können die gezielte Freisetzung von Medikamenten mit niedrigem pH-Wert oder die Erhöhung des pH-Werts untersuchen, um sie anfälliger für die Arbeit bei einem höheren pH-Wert zu machen.

Drei spezifische Merkmale dieses Bildgebungsverfahrens sind die Röntgenauflösung, die Spezifität der Implantatoberfläche und die chemische Empfindlichkeit (Abbildung 1A). Diese Merkmale können mit den derzeit verfügbaren bildgebenden Verfahren zur Bildgebung orthopädischer implantatbedingter Infektionen verglichen werden (Abbildung 1B). Nach der Bestrahlung mit Röntgenstrahlen erzeugen Phosphorpartikel, die auf der Implantatoberfläche beschichtet sind, rotes Licht und Nah-IR-Licht (NIR), das einige Zentimeter Gewebe durchdringen kann (wenn auch mit einer gewissen Dämpfung)^12,13. Tabelle 1 zeigt einige der Merkmale des entwickelten Bildgebungssystems im Vergleich zu anderen Methoden, die zur Messung des pH-Werts in Biofilmen oder durch Gewebe verwendet wurden.

XELCI ist ein neuartiges bildgebendes Verfahren zur optischen Erfassung chemischer Informationen mit hoher räumlicher Auflösung in der Nähe von implantierten medizinischen Geräten in Kombination mit Röntgenanregung, wie in Abbildung 2 dargestellt. Hier wird die selektive Anregung und optische Detektion von röntgenerregbaren Phosphorpartikeln genutzt. Das Implantat ist mit zwei Schichten beschichtet, einer pH-empfindlichen, farbstoffinkorporierten Polymerschicht über einer Schicht aus Szintillatorpartikeln. Sobald eine Sequenz von fokussierten Röntgenstrahlen das Implantat bestrahlt, erzeugt die Szintillatorschicht sichtbares Licht (620 nm und 700 nm). Dieses erzeugte Licht durchdringt die pH-empfindliche Schicht und moduliert das Lumineszenzspektrum in Abhängigkeit vom pH-Wert der Umgebung. Ein niedriger pH-Wert wird im Allgemeinen mit Infektionen und Biofilmbildung in Verbindung gebracht. Mit fortschreitender Infektion ändert sich der pH-Wert von physiologischem pH-Wert (pH 7,2) zu sauer (weniger als pH 7), und der pH-Farbstoff im Sensor ändert seine Farbe und damit seine Absorption. Die Variation des Lumineszenzspektrums ist in Abbildung 2E für den pH-Farbstoff Bromocresolgrün bei pH 7 und pH 4 dargestellt. Das durch Gewebe und Knochen durchgelassene Licht wird gesammelt und das spektrale Verhältnis bestimmt den pH-Wert. Um ein pH-Bild zu erzeugen, bestrahlt der fokussierte Röntgenstrahl jeweils einen Punkt in der Szintillatorfolie und tastet den Strahl Punkt für Punkt über die Probe ab. Zuvor wurde diese Technik angewendet, um pH-Variationen auf der Oberfläche der orthopädischen Implantate darzustellen^14,15 und wurde getestet, um pH-Variationen im Markkanal durch Knochen und Gewebe zu überwachen.

Abbildung 3 unten zeigt eine schematische Darstellung des Bildgebungssystems. Grundlegende Komponenten des Bildgebungssystems sind die Röntgenanregungsquelle mit Polykapillaroptik, ein einteiliger Acryl-Lichtleiter, der mit zwei Photomultiplier-Röhren verbunden ist, der motorisierte x-, y- und z-Tisch (30 cm x 15 cm x 6 cm Verfahrweg) und der zur Datenerfassung angeschlossene Computer. Die Röntgenquelle, der x,y,z-Tisch und die Sammeloptik (Winkel, Lichtleiter, Photomultiplier-Röhren (PMTs)) befinden sich im röntgensicheren Gehäuse, während der Röntgencontroller, die Stromquelle für PMTs, der Funktionsgenerator, der mit der Datenerfassungsplatine (DAQ) und dem Computer verbunden ist, draußen untergebracht sind. Als Verriegelung dient ein Druckknopf, Schließerschalter, der zwischen dem Gehäuse und der Vorderseite der Tür platziert ist. Wenn die Tür nicht vollständig geschlossen ist (der Verriegelungsschalter ist geöffnet), schaltet sich die Röntgenquelle nicht ein und schaltet die Röntgenquelle automatisch aus, wenn sie während des Betriebs geöffnet wird. Die Motoren können einen kontinuierlichen Scan durchführen und an einen beliebigen diskreten Ort bewegt werden. Die Scangeschwindigkeit für die y-Achse beträgt in der Regel 1-5 mm/s, während die Schrittweite auf der x-Achse typischerweise von 150-2000 μm gewählt werden kann. Die Parameter können je nach benötigter räumlicher Auflösung gewählt werden. Gleichmäßige Belichtungszeiten werden durch eine konstante Geschwindigkeit während eines kontinuierlichen Scans bestätigt.

Sobald der fokussierte Röntgenstrahl auf die Röntgenlumineszenzpartikel bestrahlt wird, durchdringt das erzeugte Licht den pH-empfindlichen Film, indem es das Licht in Abhängigkeit vom umgebenden pH-Wert moduliert. Das transmittierte Licht interagiert (streut und absorbiert teilweise) mit einem Gewebe, während die Lichtabschwächung durch Streuung und Absorption mit zunehmender Gewebedicke zunimmt. Die Optik der Kollektion umfasst einen einteiligen, gegabelten Acryl-Lichtleiter, der zu Beginn mit einem reflektierenden Aluminiumbogen (mit 90°-Biegung und polierter reflektierender Innenfläche) ausgestattet ist. Dadurch soll sichergestellt werden, dass das Licht kollimiert wird, sobald das Licht den Lichtleiter erreicht. Diese Ergänzungen verbesserten die Effizienz der Lichtsammlung erheblich. Für weitere Details zeigt Abbildung 4 die Maschinenzeichnungen des Bogens und des Lichtleiters. Der 90°-Bogen wurde aus Aluminium gefräst, die Innenfläche auf Hochglanz poliert und der Lichtleiter mit Acryl bearbeitet. Wir haben auch einen Breitband-Langpass-Blaulichtfilter (der 350-450 nm Licht blockiert) am Anfang des Ellbogens angebracht, um sicherzustellen, dass nur rotes Licht durchgelassen wird. Das Ende des einteiligen Acryl-Lichtleiters teilt sich in zwei Ströme, die zu zwei verschiedenen PMTs führen. Die PMTs sind in einer kleinen lichtdichten Metallbox eingeschlossen, die mit einem thermoelektrischen Kühler in Kontakt steht, um die PMTs auf ~5 °C abzukühlen. Am Anfang eines der PMTs ist ein Schmalbereichs-Langpassfilter (der 570-640 nm Licht blockiert und 640-740 nm Licht durchlässt) angebracht, um nur das 700 nm Licht zu messen. Daher können die Lichtverhältnisse von 620 nm und 700 nm separat berechnet werden. Die PMTs sind im Photonenzählmodus aufgebaut und erzeugen für jedes detektierte Photon Transistor-Transistor-Logik-Impulse (TTL). Ein Datenerfassungssystem zählt die Impulse (Sättigungspunkt 20 Millionen Impulse pro Sekunde) über USB-Kommunikation. Nach der Verarbeitung der Daten werden zwei separate Intensitätskarten erstellt, und unter Berücksichtigung des Verhältnisses der Signalwellenlängenintensität (620 nm) zur Referenzwellenlängenintensität (700 nm) wird ein endgültiges Bild erstellt. Dieses Verhältnis erklärt Unterschiede in der Gesamtlichtsammeleffizienz, die stark von der Position der Sammeloptik, der Röntgenbestrahlungsintensität und der Gewebedicke abhängen. Darüber hinaus ist eine räumlich getrennte Referenzregion ohne pH-Indikatorfarbstoff für die spektrale Verzerrung durch wellenlängenabhängige Gewebepenetration verantwortlich. Eine grafikbasierte Programmiersprache wird zur Steuerung des Bildgebungssystems verwendet, und ein grundlegendes Flussdiagramm des Vorgangs ist unten dargestellt. Der Bildgebungsaufbau ist mit Ausnahme des Computers, des Röntgencontrollers und der Datenerfassungseinheit in einem sicheren Röntgengehäuse untergebracht, um die Strahlenbelastung zu minimieren.

Protocol

Dieses Verfahren folgt den Tierverwendungsprotokollen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Clemson University genehmigt wurden. Die Experimente werden gemäß dem Clemson University Biosafety Committee (IBC) und dem Radiation Safety Committee (RSC) sowie unter Einhaltung der einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. HINWEIS: Ein Flussdiagramm zum Abschließen eines XELCI-Scans ist unten in Abbildung 5 dargestellt, gefol…

Representative Results

Als Vorstudie haben wir den intramedullären Stäbchensensor in einer aufgebohrten Tibia eines Kaninchenkadaversabgebildet 14. Der Sensor verfügt über drei verschiedene Bereiche: den Referenzbereich, den pH-8-Bereich (basischer pH-Wert) und den pH-4-Bereich (saurer pH-Wert). Der Referenzbereich ist das Szintillatorpartikel (Gd 2 O2S:Eu), das in eine aufgeraute Epoxidfolie eingearbeitet ist. Die charakteristischen sauren und basischen pH-Bereiche repräsentieren infizierte u…

Discussion

Um orthopädische Implantat-assoziierte Infektionen frühzeitig erkennen und untersuchen zu können, um Komplikationen durch Osteomyelitis und sekundäre chirurgische Eingriffe zu vermeiden, haben wir XELCI als neuartiges, funktionelles Bildgebungsverfahren eingeführt. Sie ist vergleichbar mit den derzeit verfügbaren Techniken zur pH-Überwachung durch Gewebe.

Bei der Positionierung der Probe für die Bildgebung verwenden wir eine Lasertraverse, die mit einer Polykapillar-Fokussieroptik verb…

Materials

90 degree elbow	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
Bromo Cresol Green	Sigma-Aldrich	45ZW10
Bromo Thymol Blue	Sigma	76-59-5
ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate	Pollock industries, White River, VT, USA	TCP 50
Ethanol	Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051	64-17-5
Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm	Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England	UKL63/N-R1
LabVIEW	National Instruments, Austin, TX
Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis)	Motion Control, Smithtown, NY, USA	AT10-60
National instruments c-DAQ 9171	National Instruments, Austin, TX	NI cDAQ™-9171
One piece acrylic light guide	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
pH 4 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5024
pH 8 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5060
Phosphate Buffer Solution	MP Biomedicals, Irvine, CA. USA	2810305
Photo multiplier tubes Model P25PC-16	SensTech, Surrey, UK	Model P25PC-16
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	ATCC 25923
Tryptic Soy Agar	Teknova, Hollister, CA, USA	T0520
Tryptic Soy Broth	EMD Millipore, Burlington, MA, USA	1005255000
X-ray source-iMOXS	Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany
X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel	Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA	LTS300 and LTS150