यहां, हम एक्स-रे उत्तेजित ल्यूमिनेसेंस केमिकल इमेजिंग (एक्सईएलसीआई) के साथ प्रत्यारोपित चिकित्सा उपकरणों के आसपास रासायनिक जानकारी के उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऑप्टिकल डिटेक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह नई इमेजिंग तकनीक हमारी प्रयोगशाला में विकसित की गई है जो प्रत्यारोपण से जुड़े संक्रमण जैव रसायन का अध्ययन करने में सक्षम बनाती है।
प्रत्यारोपण योग्य चिकित्सा उपकरणों से जुड़े माइक्रोबियल संक्रमण फ्रैक्चर निर्धारण विफलता में एक प्रमुख चिंता का विषय हैं। इस तरह के संक्रमण का प्रारंभिक निदान दूसरी सर्जरी के लिए अतिरिक्त लागत के बिना एंटीबायोटिक दवाओं के साथ सफल उन्मूलन की अनुमति देगा। यहां, हम एक्सईएलसीआई को उच्च एक्स-रे रिज़ॉल्यूशन, इम्प्लांट विशिष्टता और प्रत्यारोपित चिकित्सा उपकरणों की सतह के पास गैर-आक्रामक छवि रासायनिक सांद्रता के लिए रासायनिक संवेदनशीलता के साथ एक तकनीक के रूप में वर्णित करते हैं। उपकरणों को रासायनिक रूप से रिपोर्टिंग सतहों के साथ लेपित किया जाता है। इस रासायनिक रूप से उत्तरदायी सतह में एक प्रत्यारोपण योग्य चिकित्सा उपकरण पर लेपित दो परतें होती हैं; एक पीएच-संवेदनशील परत (ब्रोमोथिमोल ब्लू या ब्रोमोक्रेसोल ग्रीन इनकॉर्पोरेटेड हाइड्रोगेल) जिसे निगरानी के लिए लाल-प्रकाश उत्सर्जक सिंटिलेटर (जीडी2 ओ2एस: ईयू) परत पर लेपित किया जाता है। एक केंद्रित एक्स-रे बीम इम्प्लांट पर एक स्थान को विकिरणित करता है, और सिंटिलेटर (620 एनएम और 700 एनएम चोटियों के साथ) द्वारा उत्पन्न लाल प्रकाश सेंसिंग परत के माध्यम से प्रेषित होता है जो पीएच के आधार पर वर्णक्रमीय अनुपात को बदल देता है। इम्प्लांट में एक्स-रे बीम को स्कैन करके और ऊतक से गुजरने वाले प्रकाश के वर्णक्रमीय अनुपात को बिंदु-दर-बिंदु मापकर एक छवि उत्पन्न की जाती है। हमने इस इमेजिंग तकनीक का उपयोग एक संशोधित इम्प्लांटेबल प्लेट सेंसर के साथ फीमर की हड्डी की सतह पर पहले इम्प्लांट से जुड़े संक्रमणों की निगरानी के लिए किया। अब हम पीएच परिवर्तनों का अध्ययन कर रहे हैं जो टिबियल इंट्रामेडुलरी रॉड संक्रमण से होते हैं। प्री-पायलट खरगोश अध्ययन में दो अलग-अलग प्रकार के इंट्रामेडुलरी रॉड डिज़ाइन का उपयोग किया जाता है, और हमने सीखा कि एक्सईएलसीआई तकनीक का उपयोग न केवल हड्डी की सतह पर बल्कि हड्डी के अंदर भी होने वाले किसी भी रासायनिक परिवर्तन की निगरानी के लिए किया जा सकता है। इस प्रकार, यह प्रत्यारोपण से जुड़े संक्रमण जैव रसायन का अध्ययन करने के लिए गैर-प्रमुख, उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन, कम पृष्ठभूमि स्थानीय पीएच इमेजिंग को सक्षम बनाता है।
संयुक्त राज्य अमेरिका में, लगभग 2 मिलियन फ्रैक्चर निर्धारण उपकरण सालाना डाले जाते हैं, और उनमें से 5% -10% प्रत्यारोपण सेजुड़े संक्रमण का कारण बनते हैं। बायोफिल्म 2,3 की विषमता और एंटीबायोटिक प्रतिरोधी प्रकृति के कारण बाद के चरणों में एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इन संक्रमणों का इलाज करना कठिन होता है। यदि उनका जल्दी निदान किया जाता है, तो संक्रमण का इलाज एंटीबायोटिक दवाओं और सर्जिकल डिब्राइडेशन के साथ किया जा सकता है ताकि इलाज किए गए फ्रैक्चर साइट पर हार्डवेयर को बदलने के लिए दूसरी सर्जरी के लिए अतिरिक्त चिकित्सा लागत को रोका जा सके। सादे रेडियोग्राफी और अन्य उन्नत रेडियोग्राफिक तकनीकों को आर्थोपेडिक प्रत्यारोपण से जुड़े संक्रमणों, गैर-यूनियनों और संबंधित जटिलताओं के निदान में लागू किया जाता है। यद्यपि इन तकनीकों का उपयोग अक्सर आर्थोपेडिक प्रत्यारोपण में आसपास की हड्डी और ऊतक की संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए किया जाता है, वे विशिष्ट वातावरण में जैव रासायनिक जानकारी प्रदान करने में असमर्थ हैं। इस प्रकार, हमने इम्प्लांट साइट पर जैव रासायनिक जानकारी की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए एक नई एक्स-रे उत्तेजित ल्यूमिनेसेंस केमिकल इमेजिंग (एक्सईएलसीआई) तकनीक विकसित की। आर्थोपेडिक प्रत्यारोपण से जुड़े संक्रमणों का निदान आमतौर पर एक या विभिन्न साधनों के संयोजन द्वारा किया जाता है। नैदानिक अवलोकन (दर्द, सूजन, लालिमा, घाव निर्वहन, आदि) संक्रमण के पहले संकेत ों का सुझाव देते हैं। बाद में, हड्डी उपचार प्रगति की विफलता की पुष्टि करने और रोगजनक जीव 4,5 की पहचान करने के लिए रेडियोलॉजिकल और प्रयोगशाला प्रयोग किए जाते हैं। परमाणु औषधीय तकनीकजैसे कम्प्यूटरीकृत टोमोग्राफी (सीटी), चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), और रेडियोन्यूक्लियोटाइड विधियां जैसे सिंगल फोटॉन एमिशन कम्प्यूटेड टोमोग्राफी (स्पेक्ट) और पॉज़िट्रॉन एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) संक्रमित प्रत्यारोपण और संबंधित संक्रमण 6,7 के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए उपयोग में हैं। सीटी और एमआरआई क्रमशः हड्डी के परिगलन और नरम ऊतक असामान्यताओं को निर्धारित करने में फायदेमंद हैं, लेकिनधातु प्रत्यारोपण 8 के करीब दूरी पर हस्तक्षेप का कारण बनते हैं। विवो इमेजिंग कंट्रास्ट एजेंटों के रूप में रेडियोआइसोटोप-लेबल विश्लेषणों के साथ संयोजन में स्पेक्ट और पीईटी जैसी विभिन्न एक्स-रे पद्धतियों का व्यापक रूप से प्रत्यारोपण से जुड़े ऑस्टियोमाइलाइटिस2 के निदान के लिए उपयोग किया जाता है। वर्तमान अनुप्रयोगशारीरिक जानकारी उत्पन्न करने के लिए सीटी स्कैनिंग और स्पेक्ट या पीईटी से लेबलिंग डेटा दोनों को जोड़ते हैं। यद्यपि इनमें से एक या अधिक इमेजिंग तौर-तरीकों का उपयोग संक्रमण निदान में सहायता के लिए किया जाता है, वे अतिरिक्त चिकित्सा और शल्य चिकित्सा खर्चों से बचने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ उपचार शुरू करने के लिए संक्रमण से जुड़े पीएच भिन्नताओं का पता नहीं लगा सकते हैं।
इम्प्लांट से जुड़े संक्रमणों की निगरानी के लिए इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करने का मुख्य लाभ एक वर्णक्रमीय संदर्भ के साथ बायोफिल्म माइक्रोएन्वायरमेंट के बारे में जैव रासायनिक जानकारी प्रकट करने की क्षमता है। यद्यपि मुख्य ध्यान संक्रमित साइट पर इमेजिंग और मैपिंग पीएच पर है, इस विधि को प्रत्यारोपण से जुड़े संक्रमणों के लिए विशिष्ट अन्य बायोमाकर्स की निगरानी के लिए बदला जा सकता है। इस प्रकार, XELCI संक्रमण के पैथोफिज़ियोलॉजी को समझने की अनुमति देता है। उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग संक्रमण बढ़ने के साथ विषमता का मानचित्रण करने की अनुमति देता है। सतह पर पीएच जहां बायोफिल्म का गठन होता है, जैव रासायनिक परिवर्तनों को समझने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, बैक्टीरिया10,11 द्वारा एंटीबायोटिक से संबंधित तनाव प्रतिक्रियाओं के कारण अन्य माइक्रोएन्वायरमेंट परिवर्तन हो सकते हैं। सतह-विशिष्ट और उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के कारण, बायोफिल्म माइक्रोएन्वायरमेंट पर एंटीबायोटिक प्रभाव की निगरानी की जा सकती है। तकनीक का उपयोग लक्षित दवा वितरण प्रयोगों के लिए बायोफिल्म वातावरण का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। हम लक्षित कम पीएच दवा रिलीज या पीएच बढ़ाने का अध्ययन कर सकते हैं ताकि उन्हें उच्च पीएच पर काम करने के लिए अधिक संवेदनशील बनाया जा सके।
इस इमेजिंग तकनीक की तीन विशिष्ट विशेषताएं एक्स-रे रिज़ॉल्यूशन, इम्प्लांट सतह विशिष्टता और रासायनिक संवेदनशीलता (चित्रा 1 ए) हैं। इन विशेषताओं की तुलना इमेजिंग आर्थोपेडिक प्रत्यारोपण से संबंधित संक्रमणों के लिए वर्तमान में उपलब्ध इमेजिंग तकनीकों के साथ की जा सकती है (चित्रा 1 बी)। एक बार एक्स-रे के साथ विकिरणित होने के बाद, इम्प्लांट सतह पर लेपित फॉस्फोर कण लाल और निकट-आईआर (एनआईआर) प्रकाश उत्पन्न करते हैं जो कुछ सेंटीमीटर ऊतक (हालांकि कुछ क्षीणन के साथ) के माध्यम से प्रवेश कर सकते हैं। तालिका 1 अन्य तरीकों की तुलना में विकसित इमेजिंग सिस्टम की कुछ विशेषताओं को दिखाती है जिनका उपयोग बायोफिल्म में या ऊतक के माध्यम से पीएच को मापने के लिए किया गया है।
एक्सईएलसीआई एक्स-रे उत्तेजना के साथ संयोजन में प्रत्यारोपित चिकित्सा उपकरणों के पास ऑप्टिकल रूप से उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन रासायनिक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक नई इमेजिंग तकनीक है, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। यहां एक्स-रे उत्तेजक फॉस्फोर कणों के चयनात्मक उत्तेजना और ऑप्टिकल डिटेक्शन का उपयोग किया जाता है। इम्प्लांट को दो परतों के साथ लेपित किया जाता है, एक पीएच-संवेदनशील डाई शामिल बहुलक परत को सिंटिलाइज़र कणों की एक परत पर शामिल किया जाता है। एक बार जब केंद्रित एक्स-रे बीम का एक अनुक्रम प्रत्यारोपण को विकिरणित करता है, तो सिंटिलाइज़र परत दृश्य प्रकाश (620 एनएम और 700 एनएम) उत्पन्न करती है। यह उत्पादित प्रकाश आसपास के वातावरण के पीएच के आधार पर ल्यूमिनेसेंस स्पेक्ट्रम को संशोधित करने वाली पीएच-संवेदनशील परत से गुजरता है। कम पीएच आमतौर पर संक्रमण और बायोफिल्म गठन से जुड़ा होता है; जैसे-जैसे संक्रमण बढ़ता है, पीएच शारीरिक पीएच (पीएच 7.2) से अम्लीय (पीएच 7 से कम) में बदल जाता है, और सेंसर में पीएच डाई रंग बदलता है और इस प्रकार अवशोषण होता है। ल्यूमिनेसेंस स्पेक्ट्रम की भिन्नता को पीएच 7 और पीएच 4 पर ब्रोमोक्रेसोल ग्रीन पीएच डाई के लिए चित्रा 2 ई में दिखाया गया है। ऊतक और हड्डी के माध्यम से प्रेषित प्रकाश एकत्र किया जाता है और वर्णक्रमीय अनुपात पीएच निर्धारित करता है। पीएच छवि उत्पन्न करने के लिए, केंद्रित एक्स-रे बीम एक समय में सिंटिलेटर फिल्म में एक बिंदु को विकिरणित करता है और नमूने में बीम बिंदु-दर-बिंदु स्कैन करता है। इससे पहले, इस तकनीक को आर्थोपेडिक प्रत्यारोपण14,15 की सतह पर पीएच भिन्नता की छवि के लिए लागू किया गया था और हड्डी और ऊतक के माध्यम से इंट्रामेडुलरी नहर में पीएच भिन्नताओं की निगरानी के लिए इसका परीक्षण किया गया है।
नीचे दिया गया चित्र 3 इमेजिंग सिस्टम का एक योजनाबद्ध दिखाता है। इमेजिंग सिस्टम के मूल घटक पॉली केशिका प्रकाशिकी के साथ एक्स-रे उत्तेजना स्रोत, दो फोटोमल्टीप्लायर ट्यूबों से जुड़ने वाला एक-टुकड़ा ऐक्रेलिक प्रकाश गाइड, एक्स, वाई, और जेड मोटराइज्ड स्टेज (30 सेमी x 15 सेमी x 6 सेमी यात्रा) और डेटा अधिग्रहण के लिए जुड़ा कंप्यूटर है। एक्स-रे स्रोत, एक्स, वाई, जेड चरण, और संग्रह प्रकाशिकी (कोहनी, प्रकाश गाइड, फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी)) एक्स-रे प्रूफ बाड़े में हैं, जबकि एक्स-रे नियंत्रक, पीएमटी के लिए बिजली स्रोत, डेटा अधिग्रहण (डीएक्यू) बोर्ड और कंप्यूटर से जुड़े फ़ंक्शन जनरेटर को बाहर रखा गया है। एक पुश-बटन, आम तौर पर खुला स्विच, बाड़े और दरवाजे के सामने के बीच रखा जाता है, जो एक इंटरलॉक के रूप में कार्य करता है। यदि दरवाजा पूरी तरह से बंद नहीं है (इंटरलॉक स्विच खुला है), तो एक्स-रे स्रोत चालू नहीं होगा, और यह ऑपरेशन के दौरान खोले जाने पर एक्स-रे स्रोत को स्वचालित रूप से बंद कर देगा। मोटर्स एक निरंतर स्कैन निष्पादित कर सकते हैं और साथ ही उन्हें किसी भी असतत स्थान पर ले जाया जा सकता है। वाई-अक्ष के लिए स्कैन की गति आमतौर पर 1-5 मिमी / सेकंड होती है, जबकि एक्स-अक्ष पर चरण आकार आमतौर पर 150-2000 μm से चुना जा सकता है। मापदंडों को आवश्यक स्थानिक संकल्प के आधार पर चुना जा सकता है। यहां तक कि निरंतर स्कैन के दौरान लगातार गति से एक्सपोज़र समय की पुष्टि की जाती है।
एक बार जब एक्स-रे ल्यूमिनेसेंस कणों पर केंद्रित एक्स-रे बीम को विकिरणित किया जाता है, तो उत्पन्न प्रकाश आसपास के पीएच के आधार पर प्रकाश को संशोधित करके पीएच-संवेदनशील फिल्म से गुजरेगा। संचारित प्रकाश एक ऊतक के साथ बातचीत करेगा (बिखर जाएगा और आंशिक रूप से अवशोषित होगा), जबकि ऊतक की मोटाई बढ़ने पर प्रकीर्णन और अवशोषण द्वारा प्रकाश क्षीणन बढ़ जाएगा। संग्रह प्रकाशिकी में शुरुआत में एक प्रतिबिंबित एल्यूमीनियम कोहनी (90 ° मोड़ और पॉलिश प्रतिबिंबित आंतरिक सतह के साथ) के साथ फिट एक-टुकड़ा विभाजित ऐक्रेलिक लाइट गाइड शामिल है। यह सुनिश्चित करना है कि जैसे ही प्रकाश प्रकाश गाइड तक पहुंचता है, प्रकाश संयोजित हो जाता है। इन परिवर्धन ने प्रकाश संग्रह दक्षता में काफी सुधार किया। अधिक जानकारी के लिए, चित्रा 4 कोहनी और प्रकाश गाइड के मशीन चित्र दिखाता है। 90 ° कोहनी को एल्यूमीनियम से बाहर निकाला गया था, जिसमें आंतरिक सतह को दर्पण फिनिश में पॉलिश किया गया था और प्रकाश गाइड को ऐक्रेलिक के साथ मशीन किया गया था। हमने कोहनी की शुरुआत में एक व्यापक रेंज लॉन्ग-पास ब्लू लाइट फिल्टर (350-450 एनएम प्रकाश को अवरुद्ध करना) भी संलग्न किया है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि केवल लाल बत्ती ही गुजरेगी। एक-टुकड़ा ऐक्रेलिक लाइट गाइड का अंत दो धाराओं में विभाजित होता है जो दो अलग-अलग पीएमटी की ओर जाता है। पीएमटी को एक छोटे से हल्के-तंग धातु के बॉक्स में संलग्न किया जाता है जो पीएमटी को ~ 5 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के लिए थर्मोइलेक्ट्रिक कूलर के संपर्क में होता है। पीएमटी में से एक की शुरुआत में, केवल 700 एनएम प्रकाश को मापने के लिए एक संकीर्ण रेंज लॉन्ग-पास फिल्टर (570-640 एनएम प्रकाश को अवरुद्ध करना और 640-740 एनएम प्रकाश पारित करना) जुड़ा हुआ है। इसलिए, 620 एनएम और 700 एनएम प्रकाश की गणना अलग से की जा सकती है। पीएमटी को फोटॉन गिनती मोड में स्थापित किया जाता है, और वे पता लगाए गए प्रत्येक फोटॉन के लिए ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर लॉजिक (टीटीएल) पल्स उत्पन्न करते हैं। एक डीएक्यू प्रणाली यूएसबी संचार का उपयोग करके दालों (संतृप्ति बिंदु 20 मिलियन दालें प्रति सेकंड) की गणना करती है। डेटा को संसाधित करने के बाद दो अलग-अलग तीव्रता मानचित्र उत्पन्न होते हैं, और सिग्नल तरंग दैर्ध्य तीव्रता (620 एनएम) और संदर्भ तरंग दैर्ध्य तीव्रता (700 एनएम) के अनुपात पर विचार करके एक अंतिम छवि बनाई जाती है। यह अनुपात कुल प्रकाश संग्रह दक्षता में अंतर के लिए जिम्मेदार है, जो संग्रह प्रकाशिकी, एक्स-रे विकिरण तीव्रता और ऊतक मोटाई की स्थिति पर दृढ़ता से निर्भर करता है। इसके अलावा, किसी भी पीएच संकेतक डाई के बिना एक स्थानिक रूप से अलग संदर्भ क्षेत्र तरंग दैर्ध्य-निर्भर ऊतक प्रवेश से वर्णक्रमीय विकृति के लिए जिम्मेदार है। इमेजिंग सिस्टम को नियंत्रित करने के लिए एक ग्राफिक्स-आधारित प्रोग्रामिंग भाषा का उपयोग किया जाता है, और ऑपरेशन का एक बुनियादी प्रवाह चार्ट नीचे दिखाया गया है। कंप्यूटर, एक्स-रे नियंत्रक और डीएक्यू इकाई को छोड़कर इमेजिंग सेटअप, विकिरण जोखिम को कम करने के लिए एक सुरक्षित एक्स-रे बाड़े में संलग्न है।
ऑस्टियोमाइलाइटिस और माध्यमिक शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं से जटिलताओं से बचने के लिए आर्थोपेडिक प्रत्यारोपण से जुड़े संक्रमणों का पता लगाने और अध्ययन करने में सक्षम होने के लिए, हमने एक्सईएलसीआई को ए?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक क्लेम्सन विश्वविद्यालय, कॉमसेट और क्लेम्सन एससी बायोक्राफ्ट को धन्यवाद देना चाहते हैं। XELCI सेटअप शुरू में NSF CAREER CHE 12255535 और बाद में NIH NIAMS R01 AR070305-01 से धन के साथ विकसित किया गया था।
90 degree elbow | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
Bromo Cresol Green | Sigma-Aldrich | 45ZW10 | |
Bromo Thymol Blue | Sigma | 76-59-5 | |
ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate | Pollock industries, White River, VT, USA | TCP 50 | |
Ethanol | Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051 |
64-17-5 | |
Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm | Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England | UKL63/N-R1 | |
LabVIEW | National Instruments, Austin, TX | ||
Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis) | Motion Control, Smithtown, NY, USA | AT10-60 | |
National instruments c-DAQ 9171 | National Instruments, Austin, TX | NI cDAQ™-9171 | |
One piece acrylic light guide | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
pH 4 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5024 | |
pH 8 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5060 | |
Phosphate Buffer Solution | MP Biomedicals, Irvine, CA. USA | 2810305 | |
Photo multiplier tubes Model P25PC-16 | SensTech, Surrey, UK | Model P25PC-16 | |
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ATCC 25923 | |
Tryptic Soy Agar | Teknova, Hollister, CA, USA | T0520 | |
Tryptic Soy Broth | EMD Millipore, Burlington, MA, USA | 1005255000 | |
X-ray source-iMOXS | Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany | ||
X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel | Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA | LTS300 and LTS150 |