Kjemisk avbildning med høy romlig oppløsning av implantatassosierte infeksjoner med røntgeneksitert luminescens kjemisk avbildning gjennom vev

Summary

Her presenterer vi en protokoll for høyoppløselig optisk deteksjon av kjemisk informasjon rundt implantert medisinsk utstyr med røntgeneksitert luminescens kjemisk avbildning (XELCI). Denne nye bildebehandlingsteknikken er utviklet i vårt laboratorium som gjør det mulig å studere implantatassosiert infeksjonsbiokjemi.

Abstract

Mikrobielle infeksjoner forbundet med implanterbart medisinsk utstyr er en stor bekymring ved fikseringssvikt ved brudd. Tidlig diagnose av slik infeksjon vil tillate vellykket utryddelse med antibiotika uten ekstra kostnad for en annen operasjon. Her beskriver vi XELCI som en teknikk med høy røntgenoppløsning, implantatspesifisitet og kjemisk følsomhet for ikke-invasive kjemiske konsentrasjoner nær overflaten av implantert medisinsk utstyr. Enhetene er belagt med kjemisk rapporterende overflater. Denne kjemisk responsive overflaten består av to lag belagt på et implanterbart medisinsk utstyr; et pH-følsomt lag (bromothymolblått eller bromokresolgrønt inkorporert hydrogel) som er belagt over et rødlysemitterende scintillatorlag (Gd2 O₂S: Eu) for overvåking. En fokusert røntgenstråle bestråler et sted på implantatet, og det røde lyset som genereres av scintillatoren (med 620 nm og 700 nm topper) overføres gjennom sensorlaget som endrer spektralforholdet avhengig av pH. Et bilde genereres ved å skanne røntgenstrålen over implantatet og måle spektralforholdet mellom lys som passerer gjennom vevet punkt for punkt. Vi brukte denne avbildningsteknikken for å overvåke implantatassosierte infeksjoner tidligere på benoverflaten av lårbenet med en modifisert implanterbar platesensor. Nå studerer vi pH-endringer som oppstår fra tibial intramedullære stavinfeksjoner. To forskjellige typer intramedullære stavdesign brukes i pre-pilot kaninstudier, og vi lærte at XELCI-teknikken kunne brukes til å overvåke eventuelle kjemiske endringer som ikke bare skjer på beinoverflaten, men også inne i beinet. Dermed muliggjør dette ikke-invasiv, høy romlig oppløsning, lav bakgrunn lokal pH-avbildning for å studere implantatassosiert infeksjonsbiokjemi.

Introduction

I USA settes omtrent 2 millioner bruddfikseringsenheter inn årlig, og 5% -10% av dem fører til implantatassosierte infeksjoner¹. Disse infeksjonene er vanskeligere å behandle med antibiotika på senere stadier på grunn av biofilmens heterogenitet og antibiotikaresistente natur ^2,3. Hvis de diagnostiseres tidlig, kan infeksjoner behandles med antibiotika og kirurgisk debridement for å forhindre ekstra medisinske kostnader for en annen operasjon for å erstatte maskinvare på det behandlede bruddstedet. Vanlig radiografi og andre avanserte radiografiske teknikker brukes i diagnosen ortopediske implantatassosierte infeksjoner, ikke-fagforeninger og relaterte komplikasjoner. Selv om disse teknikkene ofte brukes til å skaffe strukturell informasjon om det omkringliggende bein og vev ved det ortopediske implantatet, er de ikke i stand til å gi biokjemisk informasjon i det spesifikke miljøet. Derfor utviklet vi en ny røntgeneksitert luminescens kjemisk bildebehandling (XELCI) teknikk for høyoppløselig avbildning av biokjemisk informasjon ikke-invasivt på implantatstedet. Diagnostisering av ortopediske implantatassosierte infeksjoner utføres vanligvis på en eller en kombinasjon av forskjellige måter. Kliniske observasjoner (smerte, hevelse, rødhet, sårutslipp, etc.) antyder de første tegn på infeksjon. Senere utføres radiologiske og laboratorieforsøk for å bekrefte svikt i beinhelingsprogresjon og identifisere den patogene organismen ^4,5. Nukleærmedisinske teknikker som datastyrt tomografi (CT), magnetisk resonansavbildning (MRI) og radionukleotidmetoder som Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) og Positron Emission Tomography (PET) er i bruk for bedre visualisering av det infiserte implantatet og den tilhørende infeksjonen ^6,7. CT og MR er fordelaktige for å bestemme henholdsvis bennekrose og bløtvevsavvik, men forårsaker forstyrrelser i nær avstand til metallimplantatene⁸. Ulike røntgenmetoder som SPECT og PET i kombinasjon med radioisotopmerkede analytter som in vivo bildekontrastmidler er mye brukt for å diagnostisere implantatassosiert osteomyelitt². Nåværende applikasjoner kombinerer både data fra CT-skanning og merkingsdata fra enten SPECT eller PET for å generere anatomisk informasjon⁹. Selv om en eller flere av disse bildebehandlingsmodalitetene brukes til å hjelpe infeksjonsdiagnose, kan de ikke oppdage pH-variasjonene forbundet med infeksjon tidlig for å starte behandlingene med antibiotika for å unngå ekstra medisinske og kirurgiske utgifter.

Den største fordelen med å bruke bildebehandlingssystemet som brukes i denne studien for å overvåke implantatassosierte infeksjoner, er dens evne til å avsløre biokjemisk informasjon om biofilmmikromiljøet med en spektral referanse. Selv om hovedfokuset er på avbildning og kartlegging av pH på det infiserte stedet, kan denne metoden endres for å overvåke andre biomarkører som er spesifikke for implantatassosierte infeksjoner. Dermed gjør XELCI det mulig å forstå patofysiologien til infeksjonen. Den høye romlige oppløsningen gjør det mulig å kartlegge heterogenitet etter hvert som infeksjonen vokser. pH på overflaten der biofilmdannelsen skjer er svært viktig for å forstå biokjemiske endringer. Også andre mikromiljøendringer kan oppstå på grunn av antibiotikarelaterte stressresponser av bakterier^10,11. På grunn av overflatespesifikk og høy romlig oppløsning kan den antibiotiske effekten på biofilmmikromiljøet overvåkes. Teknikken kan også brukes til å studere biofilmmiljøet for målrettede eksperimenter med legemiddellevering. Vi kan studere målrettet lav pH-frigjøring eller økning av pH for å gjøre dem mer utsatt for arbeid ved høyere pH.

Tre spesifikke kjennetegn ved denne avbildningsteknikken er røntgenoppløsning, implantatoverflatespesifisitet og kjemisk følsomhet (figur 1A). Disse karakteristika kan sammenlignes med tilgjengelige bildeteknikker for avbildning av ortopediske implantatrelaterte infeksjoner (figur 1B). Når fosforpartikler belagt på implantatoverflaten er bestrålt med røntgenstråler, genererer det rødt og nær-IR (NIR) lys som kan trenge gjennom noen få centimeter vev (om enn med en viss demping)^12,13. Tabell 1 viser noen av funksjonene i det utviklede bildesystemet sammenlignet med andre måter som har blitt brukt til å måle pH i biofilmer eller gjennom vev.

XELCI er en ny avbildningsteknikk for å skaffe kjemisk informasjon med høy romlig oppløsning optisk nær implantert medisinsk utstyr i kombinasjon med røntgeneksitasjon, som vist i figur 2. Her utnyttes selektiv eksitasjon og optisk deteksjon av røntgeneksiterbare fosforpartikler. Implantatet er belagt med to lag, et pH-følsomt fargestoff innlemmet polymerlag over et lag av scintillatorpartikler. Når en sekvens av fokuserte røntgenstråler bestråler implantatet, genererer scintillatorlaget synlig lys (620 nm og 700 nm). Dette produserte lyset passerer gjennom det pH-følsomme laget som modulerer luminescensspekteret avhengig av pH-verdien i omgivelsene. Lav pH er generelt forbundet med infeksjon og biofilmdannelse; etter hvert som infeksjonen utvikler seg, endres pH fra fysiologisk pH (pH 7,2) til sur (mindre enn pH 7), og pH-fargestoffet i sensoren endrer farge og dermed absorbans. Variasjonen i luminescensspekteret er vist i figur 2E for Bromokresolgrønn pH-fargestoff ved pH 7 og pH 4. Det overførte lyset gjennom vev og bein samles og spektralforholdet bestemmer pH. For å generere et pH-bilde, bestråler den fokuserte røntgenstrålen et punkt om gangen i scintillatorfilmen og skanner strålen punkt for punkt over prøven. Tidligere ble denne teknikken brukt på bilde-pH-variasjon på overflaten av de ortopediske implantatene^14,15 og har testet den for å overvåke pH-variasjoner i den intramedullære kanalen gjennom bein og vev.

Figur 3 nedenfor viser et skjema over bildesystemet. Grunnleggende komponenter i bildebehandlingssystemet er røntgeneksitasjonskilden med polykapillær optikk, en akryllysguide i ett stykke som kobles til to fotomultiplikatorrør, x, y og z motoriserte trinn (30 cm x 15 cm x 6 cm vandring) og datamaskinen koblet til datainnsamling. Røntgenkilden, x, y, z stadium og samlingsoptikk (albue, lysguide, fotomultiplikatorrør (PMT)) er i røntgensikker kabinett, mens røntgenkontrolleren, strømkilden for PMT, funksjonsgenerator koblet til datainnsamlingskortet (DAQ) og datamaskinen holdes utenfor. En trykknapp, normalt åpen bryter, plassert mellom kabinettet og forsiden av døren, fungerer som en sperre. Hvis døren ikke er helt lukket (sperrebryteren er åpen), slås ikke røntgenkilden på, og den slår automatisk av røntgenkilden hvis den åpnes under drift. Motorene kan utføre en kontinuerlig skanning, så vel som de kan flyttes til et hvilket som helst diskret sted. Skannehastigheten for y-aksen er vanligvis 1-5 mm/s, mens trinnstørrelsen på x-aksen typisk kan velges fra 150-2000 μm. Parametrene kan velges avhengig av den nødvendige romlige oppløsningen. Selv eksponeringstider bekreftes av konsekvent hastighet gjennom en kontinuerlig skanning.

Når den fokuserte røntgenstrålen er bestrålt på røntgenluminescenspartiklene, vil det genererte lyset passere gjennom den pH-følsomme filmen ved å modulere lyset avhengig av den omkringliggende pH. Det overførte lyset vil samhandle (spre seg og absorbere delvis) med et vev, mens lysdempingen ved spredning og absorpsjon vil øke etter hvert som vevtykkelsen øker. Kolleksjonsoptikken inkluderer en todelt akryllysguide i ett stykke utstyrt med en reflekterende aluminiumsalbue (med en 90° bøyning og polert reflekterende innvendig overflate) i begynnelsen. Dette er for å sikre at lyset kollimeres så snart lyset når lysguiden. Disse tilleggene forbedret lysinnsamlingseffektiviteten betydelig. For ytterligere detaljer viser figur 4 maskintegningene av albuen og lysføringen. Den 90 ° albuen ble maskinert ut av aluminium med den indre overflaten polert til en speilfinish og lysguiden ble maskinert med akryl. Vi har også festet et bredt spekter av langpassblått lysfilter (blokkerer 350-450 nm lys) i begynnelsen av albuen for å sikre at bare rødt lys vil passere gjennom. Enden av akryllysføringen i ett stykke forgrener seg i to bekker som fører til to forskjellige PMT-er. PMT-ene er innelukket i en liten lystett metallboks som er i kontakt med en termoelektrisk kjøler for å kjøle ned PMT-ene til ~ 5 ° C. I begynnelsen av en av PMT-ene er et langpassfilter med smalt område (blokkerer 570-640 nm lys og passerer 640-740 nm lys) festet for å måle bare 700 nm-lyset. Derfor kan lyset på 620 nm og 700 nm beregnes separat. PMT-ene er satt opp i fotontellingsmodus, og de genererer transistor-transistor-logikk (TTL) pulser for hver foton oppdaget. Et DAQ-system teller pulsene (metningspunkt 20 millioner pulser per sekund) ved hjelp av USB-kommunikasjon. To separate intensitetskart genereres etter behandling av dataene, og et endelig bilde opprettes ved å vurdere forholdet mellom signalbølgelengdeintensiteten (620 nm) og referansebølgelengdeintensiteten (700 nm). Dette forholdet står for forskjeller i total lysinnsamlingseffektivitet, som avhenger sterkt av posisjonen til oppsamlingsoptikk, røntgenbestrålingsintensitet og vevtykkelse. I tillegg står et romlig separert referanseområde uten pH-indikatorfargestoff for spektral forvrengning fra bølgelengdeavhengig vevspenetrasjon. Et grafikkbasert programmeringsspråk brukes til å kontrollere bildesystemet, og et grunnleggende flytskjema for operasjonen er vist nedenfor. Bildeoppsettet, bortsett fra datamaskinen, røntgenkontrolleren og DAQ-enheten, er innelukket i et trygt røntgenkabinett for å minimere strålingseksponering.

Protocol

Denne prosedyren følger dyrebruksprotokollene godkjent av Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Forsøkene utføres i henhold til Clemson University Biosafety Committee (IBC) og strålingssikkerhetskomiteen (RSC), samt i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter. MERK: Et flytskjema for å fullføre en XELCI-skanning er vist nedenfor i figur 5 etterfulgt av en detaljert trinnvis beskrivelse av bildeprosedyren. <p cl…

Representative Results

Som en foreløpig studie avbildet vi den intramedullære stavsensoren i en reamed tibia av en kaninkadaver14. Sensoren har tre forskjellige regioner: referanseområdet, pH 8-regionen (basisk pH) og pH 4-regionen (sur pH). Referanseområdet er scintillatorpartikkelen (Gd2O2S:Eu) inkorporert i grov epoksyfilm. De karakteristiske sure og basiske pH-regionene representerer infiserte og ikke-infiserte situasjoner inne i den intramedullære kanalen (figur 6A,B<…

Discussion

For å kunne oppdage og studere ortopediske implantatassosierte infeksjoner tidlig for å unngå komplikasjoner fra osteomyelitt og sekundære kirurgiske prosedyrer, har vi introdusert XELCI som en ny, funksjonell avbildningsteknikk. Det er sammenlignbart med dagens tilgjengelige teknikker for pH-overvåking gjennom vev.

Mens vi plasserer prøven for avbildning, bruker vi et laserkrysshode koblet til polykapillær fokuseringsoptikk med to kryssende linjeformede laserpekere i 90° vinkel for å…

Materials

90 degree elbow	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
Bromo Cresol Green	Sigma-Aldrich	45ZW10
Bromo Thymol Blue	Sigma	76-59-5
ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate	Pollock industries, White River, VT, USA	TCP 50
Ethanol	Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051	64-17-5
Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm	Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England	UKL63/N-R1
LabVIEW	National Instruments, Austin, TX
Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis)	Motion Control, Smithtown, NY, USA	AT10-60
National instruments c-DAQ 9171	National Instruments, Austin, TX	NI cDAQ™-9171
One piece acrylic light guide	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
pH 4 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5024
pH 8 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5060
Phosphate Buffer Solution	MP Biomedicals, Irvine, CA. USA	2810305
Photo multiplier tubes Model P25PC-16	SensTech, Surrey, UK	Model P25PC-16
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	ATCC 25923
Tryptic Soy Agar	Teknova, Hollister, CA, USA	T0520
Tryptic Soy Broth	EMD Millipore, Burlington, MA, USA	1005255000
X-ray source-iMOXS	Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany
X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel	Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA	LTS300 and LTS150