Hög rumslig upplösning Kemisk avbildning av implantatassocierade infektioner med röntgenexciterad luminiscens Kemisk avbildning genom vävnad

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för högupplöst optisk detektion av kemisk information kring implanterade medicintekniska produkter med röntgenexciterad luminiscenskemisk avbildning (XELCI). Denna nya bildteknik utvecklas i vårt laboratorium som gör det möjligt att studera implantatassocierad infektionsbiokemi.

Abstract

Mikrobiella infektioner i samband med implanterbara medicintekniska produkter är ett stort problem vid frakturfixeringsfel. Tidig diagnos av sådan infektion möjliggör framgångsrik utrotning med antibiotika utan extra kostnad för en andra operation. Här beskriver vi XELCI som en teknik med hög röntgenupplösning, implantatspecificitet och kemisk känslighet för icke-invasiva bildkemiska koncentrationer nära ytan på implanterade medicintekniska produkter. Enheterna är belagda med kemiskt rapporterande ytor. Denna kemiskt responsiva yta består av två lager belagda på en implanterbar medicinsk anordning; ett pH-känsligt skikt (bromtymolblått eller bromkresolgrönt inkorporerat hydrogel) som är belagt över ett lager med rödljusemitterande scintillator (Gd2 O₂S: Eu) för övervakning. En fokuserad röntgenstråle bestrålar en fläck på implantatet, och det röda ljuset som genereras av scintillatorn (med 620 nm och 700 nm toppar) överförs genom avkänningsskiktet som förändrar spektralförhållandet beroende på pH. En bild genereras genom att skanna röntgenstrålen över implantatet och mäta spektralförhållandet av ljus som passerar genom vävnaden punkt för punkt. Vi använde denna bildteknik för att övervaka implantatassocierade infektioner tidigare på lårbenets benyta med en modifierad implanterbar plattsensor. Nu studerar vi pH-förändringar som uppstår vid tibiala intramedullära stavinfektioner. Två olika typer av intramedullära stavkonstruktioner används i pre-pilot kaninstudier, och vi lärde oss att XELCI-tekniken kan användas för att övervaka eventuella kemiska förändringar som uppstår inte bara på benytan utan också inuti benet. Således möjliggör detta icke-invasiv, hög rumslig upplösning, låg bakgrund lokal pH-avbildning för att studera implantatassocierad infektionsbiokemi.

Introduction

I USA sätts cirka 2 miljoner frakturfixeringsanordningar in årligen, och 5% -10% av dem leder till implantatassocierade infektioner¹. Dessa infektioner är svårare att behandla med antibiotika i senare skeden på grund av biofilmens heterogenitet och antibiotikaresistenta natur ^2,3. Om de diagnostiseras tidigt kan infektioner behandlas med antibiotika och kirurgisk debridering för att förhindra extra medicinska kostnader för en andra operation för att ersätta hårdvara på det behandlade frakturstället. Vanlig radiografi och andra avancerade radiografiska tekniker tillämpas vid diagnos av ortopediska implantatassocierade infektioner, icke-fackföreningar och relaterade komplikationer. Även om dessa tekniker används ofta för att förvärva strukturell information om det omgivande benet och vävnaden vid det ortopediska implantatet, kan de inte ge biokemisk information i den specifika miljön. Således utvecklade vi en ny röntgenexciterad luminiscenskemisk avbildning (XELCI) teknik för högupplöst avbildning av biokemisk information icke-invasivt på implantatstället. Diagnos av ortopediska implantatrelaterade infektioner utförs vanligen på ett eller en kombination av olika sätt. Kliniska observationer (smärta, svullnad, rodnad, sårutsläpp etc.) föreslår de första tecknen på infektion. Senare utförs radiologiska och laboratorieexperiment för att bekräfta misslyckandet med benläkningsprogression och identifiera den patogena organismen ^4,5. Nuklearmedicinska tekniker som datortomografi (CT), magnetisk resonanstomografi (MRT) och radionukleotidmetoder som Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) och Positron Emission Tomography (PET) används för bättre visualisering av det infekterade implantatet och tillhörande infektion ^6,7. CT och MR är fördelaktiga vid bestämning av bennekros respektive mjukvävnadsavvikelser, men orsakar störningar på nära avstånd till metallimplantaten⁸. Olika röntgenmetoder som SPECT och PET i kombination med radioisotopmärkta analyter som kontrastmedel in vivo används i stor utsträckning för att diagnostisera implantatassocierad osteomyelit². Nuvarande applikationer kombinerar både data från CT-skanning och märkningsdata från antingen SPECT eller PET för att generera anatomisk information⁹. Även om en eller flera av dessa avbildningsmetoder används för att underlätta infektionsdiagnos, kan de inte upptäcka pH-variationerna i samband med infektion tidigt för att initiera behandlingarna med antibiotika för att undvika extra medicinska och kirurgiska kostnader.

Den största fördelen med att använda bildsystemet som används i denna studie för övervakning av implantatassocierade infektioner är dess förmåga att avslöja biokemisk information om biofilmens mikromiljö med en spektralreferens. Även om huvudfokus ligger på avbildning och kartläggning av pH på den infekterade platsen, kan denna metod ändras för att övervaka andra biomarkörer som är specifika för implantatassocierade infektioner. Således tillåter XELCI att förstå infektionens patofysiologi. Den höga rumsliga upplösningen gör det möjligt att kartlägga heterogenitet när infektionen växer. pH vid ytan där biofilmbildningen sker är mycket viktigt för att förstå biokemiska förändringar. Även andra mikromiljöförändringar kan uppstå på grund av antibiotikarelaterade stressreaktioner av bakterier^10,11. På grund av ytspecifik och hög rumslig upplösning kan den antibiotiska effekten på biofilmens mikromiljö övervakas. Tekniken kan också användas för att studera biofilmmiljön för riktade drug delivery-experiment. Vi kan studera riktad läkemedelsfrisättning med lågt pH eller höja pH för att göra dem mer mottagliga för arbete vid högre pH.

Tre specifika egenskaper hos denna bildteknik är röntgenupplösning, implantatytspecificitet och kemisk känslighet (figur 1A). Dessa egenskaper kan jämföras med de avbildningstekniker som för närvarande finns tillgängliga för avbildning av ortopediska implantatrelaterade infektioner (figur 1B). Efter bestrålning med röntgenstrålar genererar fosforpartiklar belagda på implantatytan rött och nära IR (NIR) ljus som kan tränga igenom några centimeter vävnad (om än med viss dämpning)^12,13. Tabell 1 visar några av funktionerna i det utvecklade bildsystemet jämfört med andra sätt som har använts för att mäta pH i biofilmer eller genom vävnad.

XELCI är en ny bildteknik för att förvärva kemisk information med hög rumslig upplösning optiskt nära implanterade medicintekniska produkter i kombination med röntgenexcitation, som visas i figur 2. Här utnyttjas selektiv excitation och optisk detektion av röntgenexciterbara fosforpartiklar. Implantatet är belagt med två lager, ett pH-känsligt färgämnesintegrerat polymerskikt över ett lager av scintillatorpartiklar. När en sekvens av fokuserade röntgenstrålar bestrålar implantatet genererar scintillatorskiktet synligt ljus (620 nm och 700 nm). Detta producerade ljus passerar genom det pH-känsliga skiktet och modulerar luminiscensspektrumet beroende på pH i den omgivande miljön. Lågt pH är i allmänhet förknippat med infektion och biofilmbildning; när infektionen fortskrider ändras pH från fysiologiskt pH (pH 7,2) till surt (mindre än pH 7), och pH-färgämnet i sensorn ändrar färg och därmed absorbans. Variationen i luminiscensspektrumet visas i figur 2E för bromkresolgrönt pH-färgämne vid pH 7 och pH 4. Det överförda ljuset genom vävnad och ben samlas in och spektralförhållandet bestämmer pH. För att generera en pH-bild bestrålar den fokuserade röntgenstrålen en punkt i taget i scintillatorfilmen och skannar strålen punkt för punkt över provet. Tidigare har denna teknik tillämpats på bildens pH-variation på ytan av de ortopediska implantaten^14,15 och har testat den för att övervaka pH-variationer i den intramedullära kanalen genom ben och vävnad.

Figur 3 nedan visar en schematisk bild av bildsystemet. Grundläggande komponenter i bildsystemet är röntgenexcitationskällan med polykapilläroptik, en akrylljusledare i ett stycke som ansluter till två fotomultiplikatorrör, x-, y- och z-motoriserade steget (30 cm x 15 cm x 6 cm rörelse) och datorn ansluten för datainsamling. Röntgenkällan, x, y, z-scenen och insamlingsoptiken (armbåge, ljusledare, fotomultiplikatorrör (PMT)) finns i röntgenbevishöljet, medan röntgenstyrenheten, strömkällan för PMT, funktionsgenerator ansluten till datainsamlingskortet (DAQ) och datorn hålls utanför. En tryckknapp, normalt öppen brytare, placerad mellan höljet och dörrens framsida fungerar som en förregling. Om dörren inte är helt stängd (spärrbrytaren är öppen) slås röntgenkällan inte på och den stänger automatiskt av röntgenkällan om den öppnas under drift. Motorerna kan utföra en kontinuerlig skanning såväl som de kan flyttas till vilken diskret plats som helst. Skanningshastigheten för y-axeln är vanligtvis 1-5 mm / s, medan stegstorleken på x-axeln kan väljas typiskt från 150-2000 μm. Parametrarna kan väljas beroende på önskad rumslig upplösning. Jämna exponeringstider bekräftas av konsekvent hastighet under en kontinuerlig skanning.

När den fokuserade röntgenstrålen bestrålas på röntgenluminiscenspartiklarna kommer det genererade ljuset att passera genom den pH-känsliga filmen genom att modulera ljuset beroende på det omgivande pH-värdet. Det överförda ljuset kommer att interagera (sprida och absorbera delvis) med en vävnad, medan ljusdämpningen genom spridning och absorption ökar när vävnadstjockleken ökar. Kollektionsoptiken innehåller en bifurcated akrylljusguide i ett stycke utrustad med en reflekterande aluminiumarmbåge (med en 90 ° böjning och polerad reflekterande inre yta) i början. Detta för att säkerställa att ljuset kollimeras så snart ljuset når ljusledaren. Dessa tillägg förbättrade ljusinsamlingseffektiviteten avsevärt. För ytterligare detaljer visar figur 4 maskinritningarna av armbågen och ljusstyrningen. 90 ° armbågen bearbetades av aluminium med den inre ytan polerad till en spegelfinish och ljusstyrningen bearbetades med akryl. Vi har också fäst ett brett räckvidd långpassblått ljusfilter (blockerar 350-450 nm ljus) i början av armbågen för att säkerställa att endast rött ljus passerar igenom. Änden av akrylljusledaren i ett stycke delas upp i två strömmar som leder till två olika PMT. PMT: erna är inneslutna i en liten ljustät metalllåda som är i kontakt med en termoelektrisk kylare för att kyla ner PMT: erna till ~ 5 ° C. I början av en av PMT: erna är ett smalt långpassfilter (blockerar 570-640 nm ljus och passerar 640-740 nm ljus) fäst för att mäta endast 700 nm ljus. Därför kan 620 nm och 700 nm ljus beräknas separat. PMT: erna ställs in i fotonräkningsläge och de genererar transistor-transistorlogik (TTL) pulser för varje foton som detekteras. Ett DAQ-system räknar pulserna (mättnadspunkt 20 miljoner pulser per sekund) med hjälp av USB-kommunikation. Två separata intensitetskartor genereras efter bearbetning av data, och en slutlig bild skapas genom att överväga förhållandet mellan signalvåglängdsintensiteten (620 nm) och referensvåglängdsintensiteten (700 nm). Detta förhållande står för skillnader i total ljusinsamlingseffektivitet, vilket starkt beror på insamlingsoptikens position, röntgenbestrålningsintensitet och vävnadstjocklek. Dessutom står ett rumsligt separerat referensområde utan något pH-indikatorfärgämne för spektral distorsion från våglängdsberoende vävnadspenetration. Ett grafikbaserat programmeringsspråk används för att styra bildsystemet, och ett grundläggande flödesschema för operationen visas nedan. Bildinställningen, förutom datorn, röntgenstyrenheten och DAQ-enheten, är innesluten i ett säkert röntgenhölje för att minimera strålningsexponeringen.

Protocol

Detta förfarande följer de djuranvändningsprotokoll som godkänts av Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Experimenten utförs enligt Clemson University Biosafety Committee (IBC) och strålsäkerhetskommittén (RSC) samt följer relevanta riktlinjer och föreskrifter. OBS: Ett flödesschema över slutförandet av en XELCI-skanning visas nedan i figur 5 följt av en detaljerad steg-för-steg-beskrivning av avbildningsproceduren…

Representative Results

Som en förstudie avbildade vi den intramedullära stavsensorn i en brotschad skenben av en kaninkadaver14. Sensorn har tre distinkta regioner: referensregionen, pH 8-regionen (basiskt pH) och pH4-regionen (surt pH). Referensområdet är scintillatorn (Gd 2O2S: Eu) partikel införlivad i uppruggad epoxifilm. De distinkta sura och basiska pH-regionerna representerar infekterade och icke-infekterade situationer inuti den intramedullära kanalen (figur 6A</s…

Discussion

För att kunna upptäcka och studera ortopediska implantatrelaterade infektioner tidigt för att undvika komplikationer från osteomyelit och sekundära kirurgiska ingrepp har vi introducerat XELCI som en ny, funktionell bildteknik. Det är jämförbart med de nuvarande tillgängliga teknikerna för pH-övervakning genom vävnad.

När vi placerar provet för avbildning använder vi ett laserkorshuvud anslutet till polykapillär fokuseringsoptik med två skärande linjeformade laserpekare i 90 …

Materials

90 degree elbow	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
Bromo Cresol Green	Sigma-Aldrich	45ZW10
Bromo Thymol Blue	Sigma	76-59-5
ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate	Pollock industries, White River, VT, USA	TCP 50
Ethanol	Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051	64-17-5
Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm	Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England	UKL63/N-R1
LabVIEW	National Instruments, Austin, TX
Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis)	Motion Control, Smithtown, NY, USA	AT10-60
National instruments c-DAQ 9171	National Instruments, Austin, TX	NI cDAQ™-9171
One piece acrylic light guide	Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA
pH 4 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5024
pH 8 buffer	VWR BDH Chemicals	BDH5060
Phosphate Buffer Solution	MP Biomedicals, Irvine, CA. USA	2810305
Photo multiplier tubes Model P25PC-16	SensTech, Surrey, UK	Model P25PC-16
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	ATCC 25923
Tryptic Soy Agar	Teknova, Hollister, CA, USA	T0520
Tryptic Soy Broth	EMD Millipore, Burlington, MA, USA	1005255000
X-ray source-iMOXS	Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany
X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel	Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA	LTS300 and LTS150