Mesure quantitative en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules tumorales après une transfection d’ARNm synthétique
Summary
De nombreux gènes régulés à la hausse stimulent la migration et l’invasion des cellules tumorales, ce qui entraîne un mauvais pronostic. Il est essentiel de déterminer quels gènes régulent la migration et l’invasion des cellules tumorales. Ce protocole présente une méthode permettant d’étudier en temps réel les effets de l’augmentation de l’expression d’un gène sur la migration et l’invasion des cellules tumorales.
Abstract
Les cellules tumorales sont très mobiles et invasives et présentent des profils d’expression génique altérés. La connaissance de la façon dont les changements dans l’expression des gènes régulent la migration et l’invasion des cellules tumorales est essentielle pour comprendre les mécanismes de l’infiltration des cellules tumorales dans les tissus sains voisins et les métastases. Auparavant, il a été démontré que l’inactivation des gènes suivie de la mesure en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules tumorales basée sur l’impédance permet d’identifier les gènes nécessaires à la migration et à l’invasion des cellules tumorales. Récemment, les vaccins à ARNm contre le SRAS-CoV-2 ont suscité un intérêt accru pour l’utilisation de l’ARNm synthétique à des fins thérapeutiques. Ici, la méthode utilisant l’ARNm synthétique a été révisée pour étudier l’effet de la surexpression des gènes sur la migration et l’invasion des cellules tumorales. Cette étude démontre qu’une expression génique élevée avec une transfection d’ARNm synthétique suivie d’une mesure en temps réel basée sur l’impédance peut aider à identifier les gènes qui stimulent la migration et l’invasion des cellules tumorales. Cet article de méthode fournit des détails importants sur les procédures d’examen de l’effet de l’expression modifiée des gènes sur la migration et l’invasion des cellules tumorales.
Introduction
La motilité des cellules tumorales joue un rôle crucial dans les métastases 1,2. La propagation des cellules tumorales aux tissus sains voisins et éloignés rend le traitement du cancer difficile et contribue à la récidive 3,4. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les mécanismes de motilité des cellules tumorales et de développer des stratégies thérapeutiques pertinentes. Étant donné que de nombreuses cellules tumorales ont des profils d’expression génique altérés, il est crucial de comprendre quels changements dans le profil d’expression génique conduisent à une altération de la motilité des cellules tumorales 5,6.
Plusieurs tests ont été développés pour mesurer la migration cellulaire in vitro. Certains tests ne fournissent que des informations limitées car ils ne permettent des mesures qu’à des moments précis, tandis que d’autres offrent des informations complètes sur la motilité des cellules tumorales en temps réel7. Bien que bon nombre de ces tests de motilité cellulaire puissent fournir des résultats quantitatifs à un moment donné ou au point final, ils ne fournissent pas d’informations suffisamment détaillées sur les changements dynamiques du taux de migration cellulaire au cours de la période expérimentale. De plus, il peut être difficile d’examiner les changements potentiels dans le taux de migration cellulaire en fonction de la conception expérimentale, des types de cellules et du nombre de cellules. En outre, les effets de traitements non compliqués peuvent être étudiés par la simple quantification des tests de motilité traditionnels, mais une quantification plus sophistiquée peut être nécessaire pour étudier les effets complexes de divers traitements combinés8.
Un instrument de surveillance du courant électrique d’un fond de puits à plaque de microtitration recouvert de microélectrodes a été mis au point9. L’adhérence des cellules à la surface du puits entrave le flux d’électrons, et l’impédance est corrélée à la liaison quantitative et qualitative des cellules. La présence des microélectrodes au fond du puits permet de mesurer l’adhérence, l’étalement et la prolifération des cellules. La présence des microélectrodes sous une membrane microporeuse de la chambre supérieure permet de mesurer la migration et l’invasion des cellules dans la chambre inférieure, la chambre supérieure étant recouverte de protéines de la matrice extracellulaire (MEC) pour permettre l’invasion10.
Auparavant, il a été démontré que les mesures en temps réel basées sur l’impédance de la migration et de l’invasion des cellules tumorales fournissent des données en temps réel pendant toute l’expérience, ainsi que des comparaisons et des quantifications instantanées dans diverses conditions expérimentales11. Dans cet article de méthode, l’inactivation des gènes a été induite pour tester le rôle des protéines d’intérêt dans la migration et l’invasion des cellules tumorales. Étant donné qu’un effet d’inactivation génique à part entière dans les conditions expérimentales testées a pris 3 à 4 jours après l’électroporation avec de petits ARN interférents (siRNAs)8, les cellules ont été replaquées après l’électroporation et récoltées à nouveau 3 jours plus tard pour la mesure en temps réel basée sur l’impédance de la migration et de l’invasion des cellules tumorales.
Les régulateurs CT10 de la kinase (Crk) et Crk-like (CrkL) sont des protéines adaptatrices qui interviennent dans les interactions protéine-protéine en aval de diverses voies kinases du récepteur du facteur de croissance et des voies tyrosine kinase non réceptrices12. Des niveaux élevés de protéines Crk et CrkL contribuent à un mauvais pronostic dans plusieurs cancers humains, y compris le glioblastome13. Cependant, il n’est pas clair comment des protéines Crk et CrkL élevées conduisent à un mauvais pronostic. Par conséquent, il est important de définir l’effet de la surexpression de Crk et de CrkL sur les fonctions des cellules tumorales. Auparavant, une étude de knockdown génique a été réalisée pour démontrer que des niveaux endogènes de protéines Crk et CrkL sont nécessaires à la migration et à l’invasion des cellules de glioblastome8. Ici, un système de dosage modifié a été développé pour traiter l’effet de la surexpression de Crk et CrkL sur la migration et l’invasion des cellules tumorales.
Récemment, la synthèse in vitro de l’ARNm et ses applications thérapeutiques ont fait l’objet d’un regain d’attention en raison du développement des vaccins à ARNm contre le SRAS-CoV-2 (revue par Verbeke et al.14). En outre, des progrès remarquables ont été réalisés dans l’utilisation de l’ARNm synthétique dans le cancer et d’autres maladies15,16. L’électroporation des cellules est une méthode efficace pour délivrer de l’ARNm synthétique et induire une modification génétique transitoire (revue par Campillo-Davo et al.17), et l’utilisation de l’ARNm synthétique permet une expression génique rapide et efficace dans les fibroblastes immortalisés 18. Cet article de méthode combine la surexpression des gènes à l’aide d’ARNm synthétique avec des analyses cellulaires en temps réel pour étudier la migration et l’invasion des cellules tumorales. Cependant, le schéma expérimental utilisé pour les siRNA ne fonctionne pas avec la transfection d’ARNm synthétique, car le niveau de protéines exogènes augmente rapidement et diminue progressivement lors de la transfection d’ARNm synthétique18. Par conséquent, la méthode a été modifiée pour effectuer l’analyse en temps réel de la migration et de l’invasion cellulaires juste après la transfection sans cultiver davantage les cellules.
Cet article de méthode démontre que la combinaison de mesures en temps réel basées sur l’impédance avec la transfection de cellules tumorales avec des ARNm synthétiques fournit une analyse rapide et complète des effets de la régulation positive des gènes sur la migration et l’invasion des cellules tumorales. Ce document de méthode décrit des procédures détaillées pour mesurer comment la migration et l’invasion des cellules de glioblastome sont affectées par la surexpression de Crk et CrkL. En examinant les effets dépendants de la concentration de l’ARNm synthétique sur la migration des cellules tumorales, l’article décrit clairement comment une augmentation des niveaux de protéines stimule la migration des cellules tumorales. De plus, une approche consistant à faire varier la concentration du gel ECM est présentée pour évaluer les effets des changements dans l’expression des gènes sur l’invasion des cellules tumorales.
Protocol
Representative Results
Discussion
La migration et l’invasion sont des caractéristiques importantes des cellules tumorales. La mesure de la motilité des cellules tumorales et la compréhension du mécanisme sous-jacent qui contrôle la motilité des cellules tumorales fournissent des informations essentielles sur les interventions thérapeutiques 2,27. Plusieurs méthodes ont été développées pour étudier la migration cellulaire7. Le test de cicatrisation des plaies…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Medical Writing Center de Children’s Mercy Kansas City pour l’édition de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Fondation A.R.T. de Natalie (à T.P.) et par une subvention du conseil consultatif des partenaires de MCA du Children’s Mercy Hospital (CMH) et du Centre de cancérologie de l’Université du Kansas (KUCC) (à T.P.).
Materials
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
| Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
| Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
| ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
| 1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
References
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).
- Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
- Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
- Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739 (2021).
- Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
- Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).
- Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
- Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).
- Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
- Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
- Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
- Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
- Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
- Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
- Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
- Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).
- Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
- Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
- Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
- Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).
