מדידה כמותית בזמן אמת של נדידת תאי גידול ופלישת תאים סרטניים בעקבות טרנספקציה סינתטית של mRNA

Summary

גנים רבים מעודכנים, מעודדים נדידה ופלישה של תאי גידול, מה שמוביל לפרוגנוזה גרועה. קביעה אילו גנים מווסתים נדידה ופלישה של תאי גידול היא קריטית. פרוטוקול זה מציג שיטה לחקר ההשפעות של ביטוי מוגבר של גן על נדידה ופלישה של תאי גידול בזמן אמת.

Abstract

תאי הגידול הם תנועתיים ופולשניים מאוד ומציגים דפוסי ביטוי גנים משתנים. הידע על האופן שבו שינויים בביטוי גנים מווסתים נדידה ופלישה של תאי גידול חיוני להבנת מנגנוני חדירת תאי הגידול לרקמות בריאות שכנות וגרורות. בעבר, הוכח כי הפלת גנים ואחריה מדידה מבוססת עכבה בזמן אמת של נדידת תאי הגידול ופלישתם, מאפשרת לזהות את הגנים הדרושים לנדידת תאי הגידול ולפלישתם. לאחרונה, חיסוני mRNA נגד SARS-CoV-2 הגבירו את העניין בשימוש ב- mRNA סינתטי למטרות טיפוליות. כאן, השיטה באמצעות mRNA סינתטי תוקנה כדי לחקור את ההשפעה של ביטוי יתר של גנים על נדידת תאי הגידול ופלישה. מחקר זה מדגים כי ביטוי גנים מוגבר עם טרנספקציה סינתטית של mRNA ואחריו מדידה בזמן אמת מבוססת עכבה עשויים לסייע בזיהוי הגנים המעודדים נדידת תאי גידול ופלישה. נייר שיטה זה מספק פרטים חשובים על ההליכים לבחינת ההשפעה של ביטוי גנים שונה על נדידת תאי הגידול ופלישתם.

Introduction

תנועתיות תאי הגידול ממלאת תפקיד מכריע בגרורות ^1,2. התפשטות תאי הגידול לרקמות בריאות שכנות ומרוחקות מקשה על הטיפול בסרטן ותורמת להישנות ^3,4. לכן, חיוני להבין את מנגנוני תנועתיות תאי הגידול ולפתח אסטרטגיות טיפוליות רלוונטיות. מאחר שלתאי גידול רבים יש שינויים בפרופילי ביטוי הגנים, חיוני להבין אילו שינויים בפרופיל ביטוי הגנים מובילים לשינוי בתנועתיות תאי הגידול ^5,6.

מספר בדיקות פותחו כדי למדוד נדידת תאים במבחנה. חלק מהבדיקות מספקות מידע מוגבל בלבד מכיוון שהן מאפשרות מדידות רק בנקודות זמן ספציפיות, בעוד שאחרות מציעות מידע מקיף על תנועתיות תאי הגידול בזמן אמת⁷. למרות שרבים ממבחני תנועתיות התא הללו יכולים לספק תוצאות כמותיות בזמן נתון או בנקודת הקצה, הם אינם מספקים מידע מפורט מספיק על שינויים דינמיים בקצב נדידת התאים במהלך תקופת הניסוי. בנוסף, ייתכן שיהיה קשה לבחון שינויים אפשריים בקצב נדידת התאים בהתאם לתכנון הניסוי, סוגי התאים ומספרי התאים. יתר על כן, ניתן לחקור את ההשפעות של טיפולים לא מסובכים על ידי כימות פשוט של מבחני תנועתיות מסורתיים, אך ייתכן שיהיה צורך בכימות מתוחכם יותר כדי לחקור את ההשפעות המורכבות של טיפולים משולבים שונים⁸.

פותח מכשיר לניטור הזרם החשמלי של צלחת מיקרוטיטר המכוסה היטב במיקרואלקטרודות⁹. היצמדות התאים לפני השטח של הבאר מעכבת את זרימת האלקטרונים, והעכבה מתואמת עם הקישור הכמותי והאיכותי של התאים. נוכחות המיקרואלקטרודות על קרקעית הבאר מאפשרת מדידה של הידבקות תאים, התפשטות והתפשטות. נוכחות המיקרואלקטרודות מתחת לקרום מיקרו-נקבובי של החדר העליון מאפשרת מדידה של נדידת תאים ופלישה לתוך החדר התחתון, כאשר החדר העליון מצופה בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים (ECM) כדי לאפשר פלישה¹⁰.

בעבר, הוכח כי מדידות מבוססות עכבה בזמן אמת של נדידת תאי הגידול ופלישתם מספקות נתונים בזמן אמת במהלך הניסוי כולו, כמו גם השוואות וכימות מיידיות בתנאי ניסוי שונים¹¹. במאמר שיטה זה, הושרה הפלת גנים כדי לבחון את תפקידם של חלבונים בעלי עניין בנדידת תאי גידול ופלישה. מכיוון שאפקט הפלה גנטי מלא בתנאי הניסוי שנבדקו לקח 3-4 ימים לאחר אלקטרופורציה עם רנ”א מפריע קטן (siRNAs)⁸, התאים צופו מחדש לאחר האלקטרופורציה ונקצרו מחדש 3 ימים לאחר מכן לצורך מדידה מבוססת עכבה בזמן אמת של נדידת תאי הגידול ופלישתם.

הרגולטור CT10 של קינאז (Crk) ודמוי Crk (CrkL) הם חלבוני מתאם המתווכים אינטראקציות חלבון-חלבון במורד הזרם של מסלולים שונים של קולטן גורם גדילה קינאז ומסלולים לא קולטנים טירוזין קינאז¹². רמות גבוהות של חלבוני Crk ו-CrkL תורמות לפרוגנוזה גרועה במספר סוגי סרטן בבני אדם, כולל גליובלסטומה¹³. עם זאת, לא ברור כיצד חלבוני Crk ו-CrkL גבוהים מובילים לפרוגנוזה גרועה. לכן, חשוב להגדיר את ההשפעה של ביטוי יתר Crk ו- CrkL על תפקודי תאי הגידול. בעבר, בוצע מחקר הפלה גנטית כדי להדגים כי רמות אנדוגניות של חלבוני Crk ו- CrkL נדרשות עבור נדידת תאי גליובלסטומה ופלישה⁸. כאן, פותחה מערכת בדיקה שונה כדי להתמודד עם ההשפעה של ביטוי יתר Crk ו- CrkL על נדידת תאי הגידול ופלישה.

לאחרונה, הסינתזה במבחנה של mRNA ויישומיו הטיפוליים משכו תשומת לב מחודשת עקב פיתוח חיסוני mRNA נגד SARS-CoV-2 (נסקר על ידי Verbeke et ^al.14). בנוסף, התקדמות יוצאת דופן נעשתה בשימוש mRNA סינתטי בסרטן ומחלות אחרות^15,16. אלקטרופורציה של תאים היא שיטה יעילה להעברת mRNA סינתטי ולהשראת שינוי גנטי חולף (נבדק על ידי Campillo-Davo et al.17), והשימוש ב-mRNA סינתטי מאפשר ביטוי גנים מהיר ויעיל בפיברובלסטים אימורטליים¹⁸. מאמר שיטה זה משלב ביטוי יתר של גנים באמצעות mRNA סינתטי עם אנליזות תאים בזמן אמת כדי לחקור נדידה ופלישה של תאי גידול. עם זאת, סכמת הניסוי המשמשת עבור siRNA אינה פועלת עם transfection mRNA סינתטי, כמו רמת חלבונים אקסוגניים עולה במהירות ויורדת בהדרגה עם transfection mRNA סינתטי¹⁸. לכן, השיטה שונתה כדי לבצע ניתוח בזמן אמת של נדידת תאים ופלישה מיד לאחר transfection מבלי בנוסף תרבית את התאים.

מאמר שיטה זה מדגים כי שילוב מדידות מבוססות עכבה בזמן אמת עם טרנספקציה של תאי גידול עם mRNA סינתטי מספק ניתוח מהיר ומקיף של ההשפעות של upregulation גנים על נדידת תאי הגידול ופלישה. מאמר שיטה זה מתאר נהלים מפורטים למדידת האופן שבו הגירה ופלישה של תאי גליובלסטומה מושפעים מביטוי יתר של Crk ו- CrkL. על ידי בחינת ההשפעות תלויות הריכוז של mRNA סינתטי על נדידת תאי גידול, המאמר מתאר בבירור כיצד עלייה ברמות החלבון מעודדת נדידת תאי גידול. בנוסף, מוצגת גישה של שינוי ריכוז ג’ל ECM כדי להעריך את ההשפעות של שינויים בביטוי גנים על פלישת תאי גידול.

Protocol

1. סינתזה של mRNA הערה: עבור סינתזת mRNA, כל הריאגנטים והציוד חייבים להיות מטופלים במיוחד כדי להשבית את RNases לפני השימוש. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה. ליניאריזציה של DNAהערה: cDNA עכברי של CrkI ו- CrkL</…

Representative Results

חלבוני Crk ו-CrkL ממלאים תפקידים חשובים בתנועתיות של סוגי תאים רבים, כולל תאי עצב22, תאי T23, פיברובלסטים 18,19 ומגוון תאי גידול13. מאחר שחלבוני Crk ו-CrkL דווחו כבעלי רמות גבוהות בגליובלסטומה24,25,26, נחקרו במחקר זה ההשפע?…

Discussion

הגירה ופלישה הן תכונות חשובות של תאי גידול. מדידת התנועתיות של תאי הגידול והבנת המנגנון הבסיסי השולט בתנועתיות תאי הגידול מספקים תובנות קריטיות לגבי התערבויות טיפוליות ^2,27. מספר שיטות פותחו לחקר נדידת תאים⁷. בדיקת ריפוי פצעים באמצעות שריטות או …

Materials

AlphaImager HP	ProteinSimple	92-13823-00	Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibody	Sigma	T9026	Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16	Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk antibody	BD Biosciences	610035	Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibody	Santa Cruz	sc-319	Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	ATCC	302002	Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CV	Buffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03	Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific	51030285	CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32210	Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32211	Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride	Invitrogen	AM9480	Used for RNA precipitation
Matrigel matrix	Corning	354234	Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kit	Invitrogen	AM1334	Used for RNA synthesis
Millennium RNA markers	Invitrogen	AM7150	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifuge	ISC BioExpress	C1301P-ISC	Used to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNA	TaKaRa	637301	Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuant	Tecan	M200PRO	Nucleic acid quantification system
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK10096	Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel buffer	Invitrogen	AM8676	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dye	Invitrogen	AM8552	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running buffer	Invitrogen	AM8671	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free water	Teknova	W3331	Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx Imager	Li-Cor		Imager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-His	Invitrogen	V80020	The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5a	Millipore Sigma	E7523	Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Sigma	P2069	Used for DNA extraction
PmeI	New England BioLabs	R0560L	Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kit	Invitrogen	AM1350	Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)	Corning	353003	Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)	Corning	353001	Used for culturing transfected cells
Proteinase K	Invitrogen	25530049	Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1	Labconco Corporation	304410001	Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer R	ThermoFisher Scientific		A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZap	Invitrogen	AM9780	RNA decontamination solution
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit	Cellscript	C-SCMT0625	Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping system	Cellscript	C-SCCE0625	Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solution	Invitrogen	15553-035	Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifuge	Thermo Scientific	75004532	Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Used for dissociation of cells
U-118MG	ATCC	HTB15	An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibody	Sigma	V9131	Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DP	Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).