Summary
L’analyse des changements dans la fonction contractile et l’intégrité cellulaire des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC est d’une importance capitale pour le développement de médicaments non cliniques. Un système hybride d’analyse cellulaire à 96 puits aborde les deux paramètres en temps réel et de manière physiologique pour obtenir des résultats fiables et pertinents pour l’homme, nécessaires à une transition sûre vers les stades cliniques.
Abstract
L’évaluation de la contractilité cardiaque est d’une importance capitale pour le développement de nouveaux traitements et leur transition en toute sécurité vers les stades cliniques. Alors que les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont prometteurs pour servir de modèle pertinent pour l’homme dans les phases précliniques de la découverte de médicaments et de la pharmacologie de sécurité, leur maturité est encore controversée dans la communauté scientifique et en développement constant. Nous présentons une technologie hybride de contractilité et d’impédance/potentiel de champ extracellulaire (EFP), ajoutant des caractéristiques de pro-maturation significatives à une plate-forme standard de 96 puits.
Le système d’impédance/EFP surveille la fonctionnalité cellulaire en temps réel. Outre la vitesse de battement des cellules contractiles, les lectures de spectroscopie d’impédance électrique détectent les changements morphologiques induits par les composés tels que la densité cellulaire et l’intégrité de la monocouche cellulaire. Dans l’autre composant du système d’analyse cellulaire hybride, les cellules sont cultivées sur des membranes bio-conformes qui imitent l’environnement mécanique du tissu cardiaque réel. Cet environnement physiologique favorise la maturation des CSPhi-CM in vitro, conduisant à davantage de réponses contractiles de type adulte, y compris des effets inotropes positifs après traitement à l’isoprotérénol, au S-Bay K8644 ou à l’omecamtiv mecarbil. Des paramètres tels que l’amplitude de la force de contraction (mN/mm2) et la durée de battement révèlent également les effets en aval des composés ayant une influence sur les propriétés électrophysiologiques et la manipulation du calcium.
Le système hybride fournit l’outil idéal pour l’analyse cellulaire holistique, permettant une évaluation préclinique du risque cardiaque au-delà des perspectives actuelles des tests cellulaires pertinents pour l’homme.
Introduction
L’un des principaux objectifs du développement de médicaments modernes est l’amélioration du taux de réussite du laboratoire au chevet du patient des nouveaux traitements dans le pipeline de découverte de médicaments. Les tests pharmacologiques d’innocuité de ces nouveaux médicaments révèlent souvent des réactions indésirables sur le système cardiovasculaire qui représentent près du quart du taux d’attrition des médicaments aux stades précliniques1. Le développement et l’intégration de méthodologies de nouvelle approche (MNA) jouent un rôle clé dans la modernisation de l’évaluation préclinique, en particulier des organes de batterie de base comme le cœur. Étant donné que ces méthodologies sont des approches sans animaux, l’utilisation de modèles cellulaires humains tels que les cardiomyocytes (CM) d’origine de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) est devenue le cheval de bataille au cours de la dernière décennie pour l’évaluation moderne des questions pharmacologiques et toxicologiquesde sécurité 2. Les systèmes d’essai largement utilisés pour de telles études sont les approches expérimentales à base de microélectrodes (MEA) et de colorants sensibles à la tension3.
Néanmoins, l’immaturité phénotypique et fonctionnelle revendiquée de ce type cellulaire met des obstacles à un modèle cellulaire humain idéal, avec le potentiel de réduire les écarts translationnels entre les études non cliniques et cliniques4.
D’énormes recherches ont été menées au fil des ans pour comprendre la raison du phénotype immature implicite et trouver des moyens de pousser le processus de maturation des CSPi-CM humaines in vitro.
Il a été démontré que l’absence de signaux de maturation cardiaque tels que des temps de culture cellulaire prolongés, l’absence d’autres types de cellules à proximité ou un manque de stimulation hormonale affectait le processus de maturation5. En outre, l’environnement non physiologique des plaques de culture cellulaire régulières a été identifié comme une cause importante qui entrave la maturation des CSPi-CM humaines, en raison de la rigidité physiologique manquante du substrat du cœur humain natif 5,6.
Différents systèmes de dosage axés sur les conditions physiologiques natives ont été développés pour résoudre ce problème, y compris des systèmes de culture cellulaire 3D où les cellules sont alignées en trois dimensions pour ressembler à une architecture cardiaque native au lieu de cultures cellulaires bidimensionnelles typiques7. Bien qu’une maturation améliorée soit obtenue avec des tests 3D, le besoin d’une main-d’œuvre qualifiée et le faible débit de ces systèmes entravent une utilisation abondante de celle-ci dans le processus de développement de médicaments, car le temps et le coût jouent un rôle fondamental dans l’évaluation de nouveaux traitements sur le plan financier8.
Les lectures importantes pour l’évaluation pharmacologique et toxicologique de l’innocuité des nouveaux traitements sont les changements dans les caractéristiques fonctionnelles et structurelles des CSPi-CM humaines, puisque les effets indésirables du système cardiovasculaire induits par des composés affectent généralement l’une de ces propriétés ou les deux 1,9. Des exemples bien connus de ces effets indésirables généraux sont les médicaments anticancéreux de la famille des anthracyclines. Ici, des effets fonctionnels dangereux et structurels indésirables sur le système cardiovasculaire sont largement rapportés pendant et après le traitement du cancer chez les patients ainsi qu’avec des tests cellulaires in vitro 10,11.
Dans la présente étude, nous décrivons une méthodologie complète pour l’évaluation des effets secondaires des composés fonctionnels et structurels sur les CM-HIPSC. La méthodologie comprend l’analyse de la force contractile des cardiomyocytes et de l’analyse de l’impédance/potentiel de champ extracellulaire (EFP). La force contractile est mesurée dans des conditions mécaniques physiologiques, les cellules étant cultivées sur des substrats de silicone mous (33 kPa), reflétant l’environnement mécanique du tissu cardiaque humain natif.
Le système est équipé de plaques à 96 puits pour l’analyse à haut débit des CSPi-CM humaines pour les études pharmacologiques et toxicologiques précliniques de sécurité cardiaque, et offre ainsi un avantage aux approches 3D actuellement utilisées comme le cœur de Langendorff ou les tranches cardiaques12,13.
Dans le détail, le système hybride se compose de deux modules, soit pour l’évaluation de la contractilité cardiaque dans des conditions physiologiques, soit pour l’analyse de la toxicité structurelle cellulaire en temps réel 6,14. Les deux modules fonctionnent avec des plaques spécialisées à haut débit de 96 puits pour une acquisition de données rapide et rentable.
Sans avoir besoin d’une construction 3D, le module de contractilité utilise des plaques spéciales contenant des membranes de silicone flexibles comme substrat pour les cellules au lieu du verre rigide ou du plastique qui compose généralement les plaques de culture cellulaire régulières. Les membranes reflètent les propriétés cardiaques biomécaniques humaines typiques et imitent donc les conditions in vivo de manière à haut débit. Alors que les iPSC-CM humaines échouent souvent à afficher le comportement des cardiomyocytes adultes en ce qui concerne l’inotropie positive induite par les composés dans d’autres tests cellulaires14, une réaction plus adulte peut être évaluée lorsque les cellules sont cultivées sur les plaques du module de contractilité. Dans des études antérieures, il a été démontré que les CSPi-CM présentent des effets inotropes positifs lors du traitement avec des composés tels que l’isoprotérénol, le S-Bay K8644 ou l’omecamtiv mecarbil 6,15. Ici, plusieurs paramètres de contractilité peuvent être évalués, tels que des paramètres primaires tels que l’amplitude de la force de contraction (mN/mm2), la durée du battement et la vitesse de battement, ainsi que des paramètres secondaires du cycle de contraction tels que l’aire sous la courbe, les pentes de contraction et de relaxation, les variations de taux de battement et les arythmies (Figure supplémentaire 1)16 . Les changements induits par les médicaments dans tous les paramètres sont évalués de manière non invasive par détection capacitive de distance. Les données brutes sont analysées par la suite par un logiciel spécialisé.
Le module de toxicité structurale ajoute ses paramètres uniques d’impédance et d’EFP comme lecture de la toxicité cellulaire structurelle et de l’analyse des propriétés électrophysiologiques17,18. La technologie de spectroscopie d’impédance électrique révèle des changements induits par des composés dans la densité cellulaire ou l’intégrité des cellules et des monocouches surveillée en temps réel, comme le montrent les CM-CSPi humaines traitées avec des composés cardiotoxiques connus13. Avec des lectures d’impédance à différentes fréquences (1-100 kHz), il est possible de disséquer davantage une réponse physiologique, ce qui permet de révéler des changements dans la topographie membranaire, les jonctions cellule-cellule ou cellule-matrice. L’enregistrement EFP supplémentaire des CSPi-CM humaines permet en outre d’analyser les effets électrophysiologiques induits par le traitement composé, comme l’a montré l’étude CiPA17,19.
Dans la présente étude, des CSPi-CM humaines ont été utilisées, traitées avec de l’épirubicine et de la doxorubicine, toutes deux bien décrites comme des anthracyclines cardiotoxiques, et de l’erlotinib, un inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK) présentant un risque plutôt faible de toxicité cardiovasculaire. L’évaluation chronique avec l’épirubicine, la doxorubicine et l’erlotinib a été réalisée pendant 5 jours. Le résultat montre des changements mineurs dans la contractilité et l’impédance de base lorsque les cellules ont été traitées avec l’erlotinib, mais une diminution toxique dépendante du temps et de la dose de l’amplitude de contraction et de l’impédance de base lorsqu’elles sont traitées avec l’épirubicine et la doxorubicine respectivement. Des mesures aiguës ont été effectuées avec la nifédipine, un bloqueur des canaux calciques, et montrent une diminution de l’amplitude de contraction, de la durée du potentiel de champ et de l’impédance de base, démontrant les effets secondaires cardiotoxiques de ce composé aux niveaux fonctionnel et structurel.
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Protocol
NOTE: Le flux de travail pour la mesure de la contractilité et de l’impédance/EFP est donné dans la figure supplémentaire 2.
1. Revêtement de plaque
- Ouvrez l’emballage scellé sous vide et retirez la plaque de 96 puits. Les procédures de manutention pour les plaques à 96 puits des deux modules sont les mêmes. Laissez la plaque de contraction recouverte par le protège-membrane fourni en plus jusqu’à la mesure dans le module de contractilité.
- Enduisez les plaques flexibles à 96 puits pour l’ensemencement des cardiomyocytes.
- Préparer une solution diluée d’enrobage de gel EHS en transférant 2,75 mL de solution de gel EHS prête à l’emploi dans un tube centrifuge stérile. Ajoutez ensuite 8,25 mL de DPBS avec Ca 2+ et Mg2+. Mélangez soigneusement la solution.
REMARQUE: En option, la fibronectine peut également être utilisée pour le revêtement des puits: préparer 13 mL de solution de revêtement de fibronectine dans un tube centrifuge stérile en diluant 650 μL de solution mère de fibronectine (1 μg / mL) dans 13 mL de DPBS avec Ca 2+ et Mg2+, ce qui donne une solution de travail de 50 μg / mL. Mélangez soigneusement la solution.
- Préparer une solution diluée d’enrobage de gel EHS en transférant 2,75 mL de solution de gel EHS prête à l’emploi dans un tube centrifuge stérile. Ajoutez ensuite 8,25 mL de DPBS avec Ca 2+ et Mg2+. Mélangez soigneusement la solution.
- Transférez la solution de revêtement dans un réservoir de réactifs stérile placé dans le robot d’automatisation du laboratoire.
- Ajoutez 100 μL de solution de revêtement par puits avec le robot d’automatisation de laboratoire en utilisant le programme « ADD100μL ». Replacez le couvercle sur la plaque de 96 puits et incuber pendant 3 h à 37 °C.
REMARQUE: Le programme pour le robot d’automatisation de laboratoire doit être préréglé manuellement au préalable.
2. Ensemencement de cardiomyocytes humains dérivés de CSPi dans des plaques flexibles à 96 puits (Jour 0)
- Décongeler les cellules conformément aux directives du fabricant.
- Compter les cellules à l’aide d’une chambre de comptage manuelle et ajuster les cellules dans le milieu de placage recommandé conformément aux instructions du fabricant de la cellule (p. ex., 1 x 105 cellules/puits), ce qui donne 11 x 106 cellules/11 mL pour ensemencer une plaque entière de 96 puits.
- Retirez la solution de gel EHS des puits avec le robot d’automatisation de laboratoire à l’aide du programme « REMOVE100μL ». Retirez le réservoir de réactif contenant la solution de revêtement distribuée du robot.
- Transférer la suspension cellulaire (11 mL au total) dans un réservoir de réactif stérile placé dans le robot d’automatisation du laboratoire et ensemencer les cellules avec 100 μL/puits en utilisant le programme « CELLS_ADD100 μL ».
- Immédiatement après l’ensemencement cellulaire, transférer la plaque flexible à 96 puits dans l’incubateur (37 °C, 5% CO2, humidité contrôlée) et laisser les cellules se déposer pendant la nuit.
3. Échange moyen de plaques souples à 96 puits (Jour 1)
- Réchauffer au moins 22 mL de milieu d’entretien cardiomyocytaire par plaque à 37 °C dans un tube à centrifuger de 50 mL, 18 à 24 h après l’ensemencement des plaques.
- Transférez le milieu frais (au moins 22 mL) dans un réservoir de réactif stérile et laissez-le juste à côté du robot d’automatisation du laboratoire. Placez un réservoir de réactif vide dans le robot et effectuez l’élimination du milieu avec le programme « REMOVE100μL ». Ensuite, échangez le réservoir de réactif contenant le milieu usé avec le réservoir de réactif contenant le milieu frais et distribuez 200 μL de milieu frais par puits avec le programme « ADD100μL ». Effectuez cette étape deux fois pour atteindre 200 μL/puits.
- Immédiatement après l’échange de milieu, transférez la plaque dans l’incubateur.
- Effectuer un échange de milieu (200 μL/puits) tous les deux jours jusqu’à l’ajout du composé.
4. Échange final du milieu avant l’ajout du composé (jours 5-7)
- Effectuer un changement de milieu final 4-6 h avant l’ajout du composé.
- Réchauffer au moins 22 mL de tampon d’essai pour une plaque flexible de 96 puits. Le tampon d’essai est constitué d’un milieu d’entretien ou de ses dérivés (p. ex. milieu sérique faible/nul, milieu exempt de rouge de phénol ou autres milieux isotoniques).
- Transférez le milieu frais dans un réservoir de réactif stérile et laissez-le juste à côté du robot d’automatisation du laboratoire. Placez un réservoir de réactif vide dans le robot et effectuez l’élimination du fluide. Ensuite, échangez le réservoir de réactif contenant le milieu usagé avec le réservoir de réactif contenant le milieu frais et distribuez 200 μL/puits du milieu frais.
- Immédiatement après l’échange de milieu, transférez la plaque flexible dans l’incubateur.
5. Addition de composés et enregistrement des données (jours 5-7)
NOTE: Un exemple de plan de mesure pour l’expérience est donné dans la figure supplémentaire 3.
- Préparer une solution de travail par composé à une concentration de 4x dans la hotte à flux laminaire à l’aide d’une plaque de puits régulière stérile de 96 profondeurs. La solution composée est basée sur le tampon de dosage utilisé à l’étape 4. Transférer la plaque de puits de 96 profondeurs contenant la solution composée pendant au moins 1 h dans l’incubateur pour l’ajuster au même état que la plaque flexible.
REMARQUE : La concentration de 1x de chaque médicament utilisé pour chaque expérience est fournie dans les figures et les légendes. - Transférez la plaque sur l’appareil de mesure respectif 1 h avant d’effectuer une mesure de référence.
- Ouvrez le protocole d’édition dans le logiciel de contrôle (qui fait partie du système d’analyse de cellules hybrides) et sélectionnez la contractilité ou l’impédance/EFP du mode de mesure respectif.
- Définissez la durée du balayage (longueur d’une mesure; par exemple, 30 s) et l’intervalle de répétition (temps entre les mesures; par exemple, 5 min) et enregistrez le numéro de protocole.
- Sélectionnez Démarrer le protocole > Continuer et remplissez les champs demandés.
- Enfin, sélectionnez Démarrer la mesure. Effectuer au moins trois mesures de base (balayages) à intervalles de 5 minutes peu de temps avant l’ajout du composé.
REMARQUE : Exemple de données d’une mesure de base de la contractilité à l’aide du module de contractilité avant l’addition de composés est illustrée à la figure supplémentaire 4. - Retirer 50 μL du tampon d’essai de chaque puits sans retirer la plaque flexible de 96 puits de l’appareil de mesure.
- Ajouter 50 μL de la solution composée concentrée 4x dans chaque puits de la plaque, selon le plan de mesure.
- Sélectionnez Ajouter un marqueur de région et définissez la disposition de la plaque composée et le volume de la solution composée après l’ajout du composé.
- Enfin, sélectionnez Procéder à la mesure standard ou Procéder à la série de mesures selon le plan expérimental.
6. Analyse des données
- Avec un logiciel d’enregistrement, mesurez les balayages, dont la longueur et l’intervalle de répétition sont définis par l’utilisateur.
- Avec un logiciel d’analyse, capturez automatiquement la forme du signal en lisant automatiquement des paramètres tels que l’amplitude, la fréquence de battement, la largeur d’impulsion, etc.
REMARQUE: Un signal moyenné incluant l’écart type, appelé battement moyen, est automatiquement calculé sur la base des données d’un balayage. L’utilisateur peut définir les paramètres de contractilité/IMP/EFP que le logiciel calcule et affiche. - Avec un logiciel d’analyse, calculez la courbe dose-réponse et la CI50/CE50 pour chaque composé.
REMARQUE: Les données brutes et les résultats d’analyse générés avec le logiciel d’analyse peuvent être facilement exportés dans une variété de formats. Enfin, les rapports de données sont générés automatiquement pour résumer et archiver les résultats expérimentaux. Une description complète de ce qu’un signal EFP est mesuré et comment il est mesuré est abordée dans la section 17.
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Representative Results
Les effets de l’inhibiteur de kinase erlotinib sur la contractilité des hiPSC-CMs sont illustrés à la Figure 1. Les cellules ont été traitées avec des concentrations allant de 10 nM à 10 μM pendant 5 jours et des paramètres de battement ont été enregistrés quotidiennement. L’erlotinib, un EGFR (récepteur du facteur de croissance épidermique) et un inhibiteur de la tyrosine kinase présentant un risque de cardiotoxicité comparativement faible, n’a eu une dose mineure et un effet dépendant du temps sur les CM-hiPSC qu’à des concentrations comprises dans la gamme micromolaire. À la concentration la plus faible (10 nM), l’erlotinib a induit une diminution statistiquement non significative de l’amplitude lors de la première mesure après application du composé (1 h). Dans toutes les mesures ultérieures, aucun effet comparable n’a été mesuré à cette concentration. La diminution transitoire peut être le résultat d’un effet composé, mais aussi d’une distorsion transitoire du motif de battement pendant la procédure d’addition de composé, par exemple, de nature thermique ou mécanique. Les concentrations micromolaires d’erlotinib ont montré des effets cardiotoxiques faibles mais significatifs en fonction du temps et de la dose. L’apparition de l’effet a été observée à partir de 96 h avec 1 μM d’erlotinib, tandis que 10 μM ont entraîné une diminution significative seulement 24 h après l’ajout du composé.
L’épirubicine, agent chimiothérapeutique, a eu un effet dépendant du temps et de la dose sur les CSPhi-CM (Figure 2). Les cellules ont cessé de battre dans les 24 heures suivant l’application de 10 μM d’épirubicine. Avec 1 μM, une diminution drastique de l’amplitude à 44% ± 2% du contrôle après 24 h a été suivie d’un arrêt complet du battement jusqu’à 48 heures après l’ajout du composé. À 100 nM, une diminution dépendante du temps de l’amplitude du battement sur une période de 5 jours a été observée avec une amplitude résiduelle de 25 % ± 3 % le jour 5. À la concentration la plus faible de 10 nM, l’effet de l’épirubicine était uniquement dose-dépendant, mais pas temporel, à partir de la première mesure (1 h après l’addition du composé). L’amplitude a fluctué régulièrement entre 60% et 80% de contrôle sur la période de 5 jours. Les écarts dans ce groupe étaient plus importants par rapport aux concentrations plus élevées. Une raison possible pourrait être le fait que cette concentration n’a eu un effet mesurable que sur une partie des puits.
La doxorubicine est une autre classe d’anthracyclines, et la vitalité cellulaire des hiPSC-CM a été étudiée en surveillant l’impédance de la base au fil du temps. La figure 3 montre qu’une exposition de 24 heures à la doxorubicine 300, 1, 3 et 10 μM diminue la viabilité cellulaire d’une manière dépendante de la concentration et du temps.
Nifedpinie est un inhibiteur des canaux calciques de la dihydropyridine qui bloque principalement les canaux calciques de type L. La surveillance à long terme sur 24 heures de viabilité cellulaire révèle une diminution de l’impédance de base dépendante du temps et de la concentration, qui est utilisée comme mesure de la toxicité (figure 4A). Lors de l’application de concentrations croissantes de nifédipine (3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM), les enregistrements du potentiel de champ sur les CM-HIPSC révèlent un raccourcissement dépendant de la concentration de la durée de champ normalisée (FPD) comme prévu (Figure 4B,C). L’évaluation de la nifédipine concernant la contractilité cardiaque a également montré une diminution significative de l’amplitude dépendante de la concentration lors de la mesure aiguë avec des concentrations de 10 nM et 30 nM (Figure 5).
Les résultats obtenus avec le système d’analyse de cellules hybrides démontrent que trois paramètres cardiaques (contractilité, structure et électrophysiologie) des CSPhi-CM peuvent être évalués à l’aide d’un seul système.
Figure 1 : Évaluation de la contractilité des cardiomyocytes humains dérivés de CSPi traités par erlotinib pendant 5 jours. L’axe des x montre le temps en heures, l’axe des y trace l’amplitude des paramètres en termes de pourcentage. Les astérisques représentent une signification statistique avec p < 0,05 (*) ou p < 0,01 (**) (test de Wilcoxon Mann Whitney, n = 4). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Évaluation de la contractilité des cardiomyocytes humains dérivés de CSPi traités par épirubicine anthracycline cardiotoxique pendant 5 jours. L’axe des x montre le temps en heures, l’axe des y trace l’amplitude des paramètres en termes de pourcentage. Les astérisques représentent une signification statistique avec p < 0,05 (*) ou p < 0. 01 (**) (essai de Wilcoxon Mann Whitney, n = 4). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Impédance de base des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC après traitement par doxorubicine. Évolution temporelle de l’impédance de base des cardiomyocytes humains dérivés des CSPi pendant 24 heures d’exposition à 300, 1, 3 et 10 μM de doxorubicine (n = 5). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Enregistrements d’impédance et de PFE de cardiomyocytes humains dérivés de CSPi. (A) Évolution temporelle de l’impédance de base des cardiomyocytes humains dérivés des CSPi pendant 24 h, après exposition à 3, 10, 30 et 100 nM de nifédipine (n = 5). (B) Durée du champ potentiel des cardiomyocytes humains dérivés des CSPi pendant 1 h, après exposition à 3, 10, 30 et 100 nM de nifédipine (n = 5). (C) Disposition de l’électrode de la plaque d’impédance/EFP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Évaluation de la contractilité (module de contractilité) de cardiomyocytes humains dérivés de CSPi traités par nifédipine pendant 20 min. L’axe des x montre le temps en min, l’axe des Y trace l’amplitude des paramètres en termes de pourcentage. Les astérisques représentent une signification statistique avec p < 0. 05 (*) ou p < 0,01 (**) (test de Wilcoxon Mann Whitney, n = 4). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Paramètres de contractilité et données brutes évalués avec le module de contractilité. (Gauche) Paramètres évalués avec le module de contractilité. Paramètres : Amplitude de la force de contraction (mN/mm2), durée du battement, vitesse ascendante et descendante, surface de course ascendante et descendante sous courbe (ASC), fréquence de battement, variations de vitesse de battement, événements arythmiques. (À droite) Enregistrements de données brutes de contractilité d’un puits avec un taux de battement de cardiomyocytes (A) non traités, (B) des variations de taux de battement, (C) tôt après les contractions et (D) des événements arythmiques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Flux de travail pour la mesure de la contractilité et de l’impédance/EFP. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3 : Exemple de plan de mesure pour une plaque de 96 puits. Quatre composés (surlignés en rouge, vert clair, brun et vert foncé) avec quatre concentrations et quatre répétitions sont représentés. Les témoins positifs et négatifs (p. ex. conditions de pré-culture et DMSO) sont surlignés en jaune. Les cellules de sauvegarde sont surlignées en bleu. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 4 : Exemple de données d’une mesure de base de la contractilité à l’aide du module de contractilité avant l’addition du composé. Dans chaque graphique, la moyenne de tous les cycles de contraction d’un balayage est représentée. Pour visualiser le taux de battement, deux contractions consécutives sont affichées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le système hybride impédance/EFP/contractilité est une méthodologie complète pour l’évaluation pharmacologique et toxicologique de sécurité à haut débit des passifs cardiaques pour le développement préclinique de médicaments. Il fournit une approche moderne pour les tests de sécurité précliniques sans l’utilisation de modèles animaux, mais avec des capacités de débit plus élevées qui réduisent considérablement le temps et les coûts. Ce système a le potentiel d’être utilisé comme une approche complémentaire pour le cœur de Langendorff et d’autres modèles animaux pour l’évaluation préclinique de la toxicité fonctionnelle et structurelle.
En tant qu’approche sans animaux, des CM-CSPi humains sont utilisés pour le système hybride20. Ici, les plaques flexibles spéciales à 96 puits ayant un effet de promaturation sur les CM-iPSC humaines offrent un avantage important par rapport à d’autres essais cellulaires21,22, puisque le débit et un environnement physiologique sont combinés de manière unique pour une évaluation du risque cardiaque humain plus adulte 6,15.
L’étape la plus critique du protocole est l’application du composé, en particulier lorsque les effets aigus doivent être examinés. Étant donné que les cellules sont cultivées sur des substrats mous qui conduisent les forces mécaniques, une accélération excessive lors de la manipulation des plaques et l’application de forces de cisaillement pendant le pipetage peuvent entraîner des altérations transitoires (5-10 min) des paramètres de contraction et doivent être évitées. En général, des précautions doivent être prises lors des remplacements de milieux pour éviter toute perturbation des membranes. L’utilisation d’équipement d’automatisation de laboratoire est recommandée.
Avant que l’analyse du composé ne soit effectuée, une étape de pré-culture de 5 à 7 jours est nécessaire, afin que les CSPi-CM humains, généralement acquis dans un état cryo-conservé, puissent récupérer de la procédure de décongélation et construire un syncytium approprié. Pour les deux modules, l’amplitude de contraction, ainsi que la vitesse de battement, donnent un aperçu du point de départ idéal de la mesure qui se produit généralement entre les jours 5 et 7. La mesure de référence est une étape critique pour identifier les caractéristiques fonctionnelles de base utilisées comme critères d’inclusion pour les CM-CSPh étudiés3. Les valeurs de base doivent être enregistrées juste avant le traitement composé afin que les changements de comportement de contraction puissent être comparés à des conditions non liées au traitement (Figure supplémentaire 3).
La prise en compte des variabilités et la définition des caractéristiques de base sont essentielles à la réussite des mesures de la CM-CSPhi et de l’interprétation des données. Pour cette raison, les recommandations de pratiques exemplaires de Gintant et al. sont suivies à l’aide du système d’analyse de cellules hybrides; Par exemple, la ligne de base doit être enregistrée avant l’ajout du composé, et l’enregistrement de référence doit remplir certaines conditions préalables3.
Bien que les plaques flexibles à 96 puits soient équipées de membranes fragiles, une plaque de protection fournie en combinaison avec une manipulation prudente évitera les dommages. Les membranes sont prétraitées pour permettre une fixation stable des cellules au substrat de silicone, qui présente une faible biocompatibilité intrinsèque. Le traitement est stable pendant au moins 6 mois. Alors que les cellules sont constamment maintenues à 37 °C, les propriétés mécaniques des matériaux en silicone sont stables sur une large plage de températures. De plus, ni les médicaments ni les solvants n’ont d’impact sur les propriétés du silicone aux concentrations utilisées dans les essais cellulaires (par exemple, les concentrations de DMSO restent inférieures à 0,1%).
Le système a été validé et optimisé avec une large gamme de hiPSC-CM disponibles dans le commerce. Lors de l’utilisation de cellules sur mesure, il est recommandé de tester les protéines de la matrice extracellulaire standard (ECM) pour une fixation cellulaire optimale (par exemple, fibronectine, matrice EHS et poly-L-lysine 6,15).
L’électrophysiologie, la signalisation calcique et la contractilité sont les trois principaux critères d’évaluation cardiaques abordés dans le développement préclinique. Le système hybride se limite actuellement à l’analyse de deux de ces paramètres cardiaques : la contractilité et l’électrophysiologie. La signalisation calcique dans les cardiomyocytes ne peut pas être analysée directement, mais détectée tangentiellement via la contractilité et les propriétés électrophysiologiques.
La mesure de l’impédance/EFP ainsi que la mesure de la force de contraction sont effectuées avec des monocouches de cardiomyocytes. Malgré l’avantage d’une rigidité mécanique physiologique du substrat lors de la mesure de contraction, les cellules ne subissent pas l’environnement tridimensionnel d’un tissu humain réel. D’autre part, cela ne permet d’utiliser qu’une fraction des modèles coûteux de cellules dérivées de cellules souches avec un équipement de laboratoire standard. Par conséquent, cette application promet d’avoir une relation favorable de coût, de robustesse et de prédictivité par rapport aux modèles in vivo / ex vivo ou 3D. Les applications futures du système hybride pourraient inclure l’analyse d’autres types de cellules contractiles telles que les cellules musculaires lisses. Dans la régulation de l’homéostasie cardiovasculaire, ces cellules jouent un rôle majeur en tant que contreparties des cardiomyocytes. Le système hybride fournit également des add-ons pour des projets spécifiques, tels que la stimulation optique des iPSC-CM humains. À cette fin, un couvercle optique dédié peut être appliqué aux deux modules pour la stimulation des iPSC-CM humaines qui ont été transfectées avec Channelrhodopsin-2 pendant les périodes de préculture.
Ainsi, le système hybride impédance/EFP/contractilité permet une évaluation préclinique moderne de l’innocuité et de la toxicité en analysant trois paramètres cardiaques différents (contractilité, changements structurels et électrophysiologie) au sein d’une méthodologie. L’avantage de traiter ces paramètres avec un modèle de cellules cardiaques humain à haut débit élève ce système hybride au-delà des perspectives actuelles d’évaluation préclinique du risque cardiaque.
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Disclosures
B.L., M.Go. et P.L. sont employés chez innoVitro GmbH, fabricant des plaques flexibles. U.T., E.D., M.L., M.Ge., N.F. et S.S. sont employés par Nanion Technologies GmbH, fabricant de l’appareil hybride.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère fédéral allemand de l’Économie et de l’Action pour le climat (ZIM) et du ministère fédéral allemand de l’Éducation et de la Recherche (KMUinnovativ). Nous remercions FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, États-Unis) d’avoir aimablement fourni des cardiomyocytes et Ncardia B.V. (Leiden, Pays-Bas) d’avoir aimablement fourni des cardiomyocytes, utilisés dans cette étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
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