Sistema de Análise de Células Híbridas para Avaliação de Alterações Estruturais e Contráteis de Cardiomiócitos Derivados de iPSC Humanos para Avaliação Pré-Clínica de Risco Cardíaco
Summary
A análise de alterações na função contrátil e integridade celular de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC é de imensa importância para o desenvolvimento de medicamentos não clínicos. Um sistema híbrido de análise celular de 96 poços aborda ambos os parâmetros de maneira fisiológica e em tempo real para obter resultados confiáveis e relevantes para o ser humano, necessários para uma transição segura para os estágios clínicos.
Abstract
A avaliação da contratilidade cardíaca é de imensa importância para o desenvolvimento de novas terapêuticas e sua transição segura para os estágios clínicos. Embora os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) prometam servir como um modelo relevante para o ser humano em fases pré-clínicas de descoberta de medicamentos e farmacologia de segurança, sua maturidade ainda é controversa na comunidade científica e em constante desenvolvimento. Apresentamos uma tecnologia híbrida de contratilidade e impedância/potencial de campo extracelular (EFP), adicionando recursos significativos de promaturação a uma plataforma de 96 poços padrão da indústria.
O sistema de impedância/EFP monitora a funcionalidade celular em tempo real. Além da taxa de batimento das células contráteis, as leituras de espectroscopia de impedância elétrica detectam alterações morfológicas induzidas por compostos, como densidade celular e integridade da monocamada celular. No outro componente do sistema de análise de células híbridas, as células são cultivadas em membranas bio-compatíveis que imitam o ambiente mecânico do tecido cardíaco real. Este ambiente fisiológico suporta a maturação de hiPSC-CMs in vitro, levando a respostas contráteis semelhantes a mais adultos, incluindo efeitos inotrópicos positivos após o tratamento com isoproterenol, S-Bay K8644 ou omecamtiv mecarbil. Parâmetros como a amplitude da força de contração (mN/mm2) e a duração do batimento também revelam efeitos a jusante de compostos com influência nas propriedades eletrofisiológicas e no manuseio do cálcio.
O sistema híbrido fornece a ferramenta ideal para a análise holística de células, permitindo a avaliação pré-clínica do risco cardíaco além das perspectivas atuais de ensaios baseados em células relevantes para humanos.
Introduction
Um dos principais objetivos do desenvolvimento de medicamentos modernos é a melhoria da taxa de sucesso do banco ao leito de novas terapêuticas no pipeline de descoberta de medicamentos. O teste farmacológico de segurança desses novos medicamentos geralmente revela reações adversas a medicamentos no sistema cardiovascular que representam quase um quarto da taxa de atrito de medicamentos nos estágios pré-clínicos1. O desenvolvimento e a integração de novas metodologias de abordagem (NAMs) desempenham um papel fundamental na modernização da avaliação pré-clínica, em particular dos órgãos da bateria central, como o coração. Como essas metodologias são abordagens livres de animais, o uso de modelos celulares de base humana, como cardiomiócitos (MCs) de origem de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), tornou-se o cavalo de batalha na última década para a avaliação moderna de questões farmacológicas e toxicológicas de segurança2. Os sistemas de ensaio amplamente utilizados para tais investigações são as abordagens experimentais baseadas em microeletrodos (MEA) e corantes sensíveis à tensão3.
No entanto, a alegada imaturidade fenotípica e funcional desse tipo de célula coloca obstáculos no caminho de um modelo celular ideal de base humana, com o potencial de reduzir as lacunas translacionais entre estudos não clínicos e clínicos4.
Uma tremenda pesquisa foi conduzida ao longo dos anos para entender a razão do fenótipo imaturo implícito e encontrar maneiras de impulsionar o processo de maturação dos iPSC-CMs humanos in vitro.
A falta de sinais de maturação cardíaca, como tempos prolongados de cultura celular, ausência de outros tipos de células nas proximidades ou falta de estimulação hormonal, mostrou afetar o processo de maturação5. Além disso, o ambiente não fisiológico das placas regulares de cultura celular foi identificado como uma causa significativa que impede a maturação dos CMiPS humanos, devido à falta de rigidez fisiológica do substrato do coração humano nativo 5,6.
Diferentes sistemas de ensaio com foco em condições fisiológicas nativas foram desenvolvidos para lidar com essa questão, incluindo sistemas de cultura de células 3D em que as células são alinhadas tridimensionalmente para se assemelharem à arquitetura cardíaca nativa em vez de culturas celulares bidimensionais típicas7. Embora a maturação melhorada seja obtida com ensaios 3D, a necessidade de uma força de trabalho qualificada e o baixo rendimento desses sistemas dificultam um uso abundante deste no processo de desenvolvimento de medicamentos, uma vez que o tempo e o custo desempenham um papel fundamental na avaliação de novas terapêuticas em nível financeiro8.
Leituras importantes para avaliação farmacológica e toxicológica de segurança de novas terapêuticas são alterações nas características funcionais e estruturais dos CMiPS humanos, uma vez que as reações adversas medicamentosas induzidas por compostos do sistema cardiovascular geralmente afetam uma ou ambas as propriedades 1,9. Exemplos bem conhecidos de reações adversas tão amplas são medicamentos anticancerígenos da família das antraciclinas. Aqui, efeitos funcionais e estruturais adversos perigosos sobre o sistema cardiovascular são amplamente relatados durante e após o tratamento do câncer em pacientes, bem como com ensaios in vitro baseados em células10,11.
No presente estudo, descrevemos uma metodologia abrangente para a avaliação dos efeitos colaterais de compostos funcionais e estruturais em CM-hiPSC. A metodologia inclui a análise da força contrátil dos cardiomiócitos e da impedância/análise do Potencial de Campo Extracelular (PPE). A força contrátil é medida sob condições fisiológicas mecânicas, com as células cultivadas em substratos de silicone macios (33 kPa), refletindo o ambiente mecânico do tecido cardíaco humano nativo.
O sistema é equipado com placas de 96 poços para análise de alto rendimento de CMiPS humanos para estudos farmacológicos e toxicológicos pré-clínicos de segurança cardíaca e, portanto, oferece uma vantagem às abordagens 3D atualmente usadas, como coração de Langendorff ou fatias cardíacas12,13.
Em detalhes, o sistema híbrido é composto por dois módulos, seja para a avaliação da contratilidade cardíaca em condições fisiológicas ou para a análise da toxicidade estrutural celular em tempo real 6,14. Ambos os módulos trabalham com placas especializadas de alto rendimento de 96 poços para aquisição de dados rápida e econômica.
Sem a necessidade de uma construção 3D, o módulo de contratilidade emprega placas especiais que contêm membranas de silicone flexíveis como substrato para as células, em vez do vidro rígido ou plástico que as placas de cultura celular regulares geralmente consistem. As membranas refletem as propriedades biomecânicas típicas do coração humano e, portanto, imitam as condições in vivo de uma maneira de alto rendimento. Embora as CMiPSC humanas muitas vezes não apresentem o comportamento dos cardiomiócitos adultos em relação à inotropia positiva induzida por compostos em outros ensaios baseados em células14, uma reação mais semelhante à adulta pode ser avaliada quando as células são cultivadas nas placas do módulo de contratilidade. Em estudos anteriores, foi demonstrado que as CMi iPSC apresentam efeitos inotrópicos positivos no tratamento com compostos como isoproterenol, S-Bay K8644 ou omecamtiv mecarbil 6,15. Aqui, múltiplos parâmetros de contratilidade podem ser avaliados, como parâmetros primários como a amplitude da força de contração (mN/mm2), duração do batimento e taxa de batimento, bem como parâmetros secundários do ciclo de contração, como área sob a curva, inclinações de contração e relaxamento, variações da taxa de batimento e arritmias (Figura Suplementar 1)16 . As alterações induzidas por drogas em todos os parâmetros são avaliadas de forma não invasiva por detecção capacitiva de distância. Os dados brutos são analisados posteriormente por softwares especializados.
O módulo de toxicidade estrutural adiciona seus parâmetros únicos de impedância e EFP como leitura da toxicidade celular estrutural e da análise das propriedades eletrofisiológicas17,18. A tecnologia de espectroscopia de impedância elétrica revela alterações induzidas por compostos na densidade celular ou na integridade celular e monocamada monitoradas em tempo real, como demonstrado com CMiPSC humanos tratados com compostos cardiotóxicos conhecidos13. Com leituras de impedância em diferentes frequências (1-100 kHz) é possível dissecar ainda mais uma resposta fisiológica e, assim, revelar mudanças na topografia da membrana, nas junções célula-célula ou célula-matriz é alcançável. O registro adicional de PFE de CMiPS humanos possibilita ainda a análise dos efeitos eletrofisiológicos provocados pelo tratamento composto, como foi demonstrado à luz do estudo CiPA17,19.
No presente estudo, foram empregados CMiPSC humanos, tratados com epirrubicina e doxorrubicina, ambos bem descritos como antraciclinas cardiotóxicas, e erlotinibe, um inibidor da tirosina quinase (TKI) com um risco bastante baixo de toxicidade cardiovascular. A avaliação crônica com epirrubicina, doxorrubicina e erlotinibe foi realizada por 5 dias. O resultado mostra pequenas alterações na contratilidade e impedância de bases quando as células foram tratadas com erlotinib, mas uma diminuição tóxica dependente do tempo e da dose na amplitude de contração e impedância de base quando tratadas com epirrubicina e doxorrubicina, respectivamente. As medidas agudas foram realizadas com o bloqueador dos canais de cálcio nifedipina e mostraram uma diminuição na amplitude de contração, duração do potencial de campo e impedância de base, demonstrando efeitos colaterais cardiotóxicos deste composto nos níveis funcionais e estruturais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sistema híbrido impedância/EFP/contratilidade é uma metodologia abrangente para avaliação farmacológica e toxicológica de alta segurança de rendimento de passivos cardíacos para o desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos. Ele fornece uma abordagem moderna para testes de segurança pré-clínicos sem o uso de modelos animais, mas com maiores capacidades de rendimento que reduzem significativamente o tempo e os custos. Este sistema tem o potencial de ser usado como uma abordagem complementar para o Langend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subvenções do Ministério Federal Alemão para Assuntos Econômicos e Ação Climática (ZIM) e do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (KMUinnovativ). Agradecemos à FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, EUA) por gentilmente fornecer cardiomiócitos e à Ncardia B.V. (Leiden, Holanda) por gentilmente fornecer cardiomiócitos, usados neste estudo.
Materials
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
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