Système d’analyse cellulaire hybride pour évaluer les changements structurels et contractiles de cardiomyocytes humains dérivés de CSPi pour l’évaluation préclinique du risque cardiaque
Summary
L’analyse des changements dans la fonction contractile et l’intégrité cellulaire des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC est d’une importance capitale pour le développement de médicaments non cliniques. Un système hybride d’analyse cellulaire à 96 puits aborde les deux paramètres en temps réel et de manière physiologique pour obtenir des résultats fiables et pertinents pour l’homme, nécessaires à une transition sûre vers les stades cliniques.
Abstract
L’évaluation de la contractilité cardiaque est d’une importance capitale pour le développement de nouveaux traitements et leur transition en toute sécurité vers les stades cliniques. Alors que les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont prometteurs pour servir de modèle pertinent pour l’homme dans les phases précliniques de la découverte de médicaments et de la pharmacologie de sécurité, leur maturité est encore controversée dans la communauté scientifique et en développement constant. Nous présentons une technologie hybride de contractilité et d’impédance/potentiel de champ extracellulaire (EFP), ajoutant des caractéristiques de pro-maturation significatives à une plate-forme standard de 96 puits.
Le système d’impédance/EFP surveille la fonctionnalité cellulaire en temps réel. Outre la vitesse de battement des cellules contractiles, les lectures de spectroscopie d’impédance électrique détectent les changements morphologiques induits par les composés tels que la densité cellulaire et l’intégrité de la monocouche cellulaire. Dans l’autre composant du système d’analyse cellulaire hybride, les cellules sont cultivées sur des membranes bio-conformes qui imitent l’environnement mécanique du tissu cardiaque réel. Cet environnement physiologique favorise la maturation des CSPhi-CM in vitro, conduisant à davantage de réponses contractiles de type adulte, y compris des effets inotropes positifs après traitement à l’isoprotérénol, au S-Bay K8644 ou à l’omecamtiv mecarbil. Des paramètres tels que l’amplitude de la force de contraction (mN/mm2) et la durée de battement révèlent également les effets en aval des composés ayant une influence sur les propriétés électrophysiologiques et la manipulation du calcium.
Le système hybride fournit l’outil idéal pour l’analyse cellulaire holistique, permettant une évaluation préclinique du risque cardiaque au-delà des perspectives actuelles des tests cellulaires pertinents pour l’homme.
Introduction
L’un des principaux objectifs du développement de médicaments modernes est l’amélioration du taux de réussite du laboratoire au chevet du patient des nouveaux traitements dans le pipeline de découverte de médicaments. Les tests pharmacologiques d’innocuité de ces nouveaux médicaments révèlent souvent des réactions indésirables sur le système cardiovasculaire qui représentent près du quart du taux d’attrition des médicaments aux stades précliniques1. Le développement et l’intégration de méthodologies de nouvelle approche (MNA) jouent un rôle clé dans la modernisation de l’évaluation préclinique, en particulier des organes de batterie de base comme le cœur. Étant donné que ces méthodologies sont des approches sans animaux, l’utilisation de modèles cellulaires humains tels que les cardiomyocytes (CM) d’origine de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) est devenue le cheval de bataille au cours de la dernière décennie pour l’évaluation moderne des questions pharmacologiques et toxicologiquesde sécurité 2. Les systèmes d’essai largement utilisés pour de telles études sont les approches expérimentales à base de microélectrodes (MEA) et de colorants sensibles à la tension3.
Néanmoins, l’immaturité phénotypique et fonctionnelle revendiquée de ce type cellulaire met des obstacles à un modèle cellulaire humain idéal, avec le potentiel de réduire les écarts translationnels entre les études non cliniques et cliniques4.
D’énormes recherches ont été menées au fil des ans pour comprendre la raison du phénotype immature implicite et trouver des moyens de pousser le processus de maturation des CSPi-CM humaines in vitro.
Il a été démontré que l’absence de signaux de maturation cardiaque tels que des temps de culture cellulaire prolongés, l’absence d’autres types de cellules à proximité ou un manque de stimulation hormonale affectait le processus de maturation5. En outre, l’environnement non physiologique des plaques de culture cellulaire régulières a été identifié comme une cause importante qui entrave la maturation des CSPi-CM humaines, en raison de la rigidité physiologique manquante du substrat du cœur humain natif 5,6.
Différents systèmes de dosage axés sur les conditions physiologiques natives ont été développés pour résoudre ce problème, y compris des systèmes de culture cellulaire 3D où les cellules sont alignées en trois dimensions pour ressembler à une architecture cardiaque native au lieu de cultures cellulaires bidimensionnelles typiques7. Bien qu’une maturation améliorée soit obtenue avec des tests 3D, le besoin d’une main-d’œuvre qualifiée et le faible débit de ces systèmes entravent une utilisation abondante de celle-ci dans le processus de développement de médicaments, car le temps et le coût jouent un rôle fondamental dans l’évaluation de nouveaux traitements sur le plan financier8.
Les lectures importantes pour l’évaluation pharmacologique et toxicologique de l’innocuité des nouveaux traitements sont les changements dans les caractéristiques fonctionnelles et structurelles des CSPi-CM humaines, puisque les effets indésirables du système cardiovasculaire induits par des composés affectent généralement l’une de ces propriétés ou les deux 1,9. Des exemples bien connus de ces effets indésirables généraux sont les médicaments anticancéreux de la famille des anthracyclines. Ici, des effets fonctionnels dangereux et structurels indésirables sur le système cardiovasculaire sont largement rapportés pendant et après le traitement du cancer chez les patients ainsi qu’avec des tests cellulaires in vitro 10,11.
Dans la présente étude, nous décrivons une méthodologie complète pour l’évaluation des effets secondaires des composés fonctionnels et structurels sur les CM-HIPSC. La méthodologie comprend l’analyse de la force contractile des cardiomyocytes et de l’analyse de l’impédance/potentiel de champ extracellulaire (EFP). La force contractile est mesurée dans des conditions mécaniques physiologiques, les cellules étant cultivées sur des substrats de silicone mous (33 kPa), reflétant l’environnement mécanique du tissu cardiaque humain natif.
Le système est équipé de plaques à 96 puits pour l’analyse à haut débit des CSPi-CM humaines pour les études pharmacologiques et toxicologiques précliniques de sécurité cardiaque, et offre ainsi un avantage aux approches 3D actuellement utilisées comme le cœur de Langendorff ou les tranches cardiaques12,13.
Dans le détail, le système hybride se compose de deux modules, soit pour l’évaluation de la contractilité cardiaque dans des conditions physiologiques, soit pour l’analyse de la toxicité structurelle cellulaire en temps réel 6,14. Les deux modules fonctionnent avec des plaques spécialisées à haut débit de 96 puits pour une acquisition de données rapide et rentable.
Sans avoir besoin d’une construction 3D, le module de contractilité utilise des plaques spéciales contenant des membranes de silicone flexibles comme substrat pour les cellules au lieu du verre rigide ou du plastique qui compose généralement les plaques de culture cellulaire régulières. Les membranes reflètent les propriétés cardiaques biomécaniques humaines typiques et imitent donc les conditions in vivo de manière à haut débit. Alors que les iPSC-CM humaines échouent souvent à afficher le comportement des cardiomyocytes adultes en ce qui concerne l’inotropie positive induite par les composés dans d’autres tests cellulaires14, une réaction plus adulte peut être évaluée lorsque les cellules sont cultivées sur les plaques du module de contractilité. Dans des études antérieures, il a été démontré que les CSPi-CM présentent des effets inotropes positifs lors du traitement avec des composés tels que l’isoprotérénol, le S-Bay K8644 ou l’omecamtiv mecarbil 6,15. Ici, plusieurs paramètres de contractilité peuvent être évalués, tels que des paramètres primaires tels que l’amplitude de la force de contraction (mN/mm2), la durée du battement et la vitesse de battement, ainsi que des paramètres secondaires du cycle de contraction tels que l’aire sous la courbe, les pentes de contraction et de relaxation, les variations de taux de battement et les arythmies (Figure supplémentaire 1)16 . Les changements induits par les médicaments dans tous les paramètres sont évalués de manière non invasive par détection capacitive de distance. Les données brutes sont analysées par la suite par un logiciel spécialisé.
Le module de toxicité structurale ajoute ses paramètres uniques d’impédance et d’EFP comme lecture de la toxicité cellulaire structurelle et de l’analyse des propriétés électrophysiologiques17,18. La technologie de spectroscopie d’impédance électrique révèle des changements induits par des composés dans la densité cellulaire ou l’intégrité des cellules et des monocouches surveillée en temps réel, comme le montrent les CM-CSPi humaines traitées avec des composés cardiotoxiques connus13. Avec des lectures d’impédance à différentes fréquences (1-100 kHz), il est possible de disséquer davantage une réponse physiologique, ce qui permet de révéler des changements dans la topographie membranaire, les jonctions cellule-cellule ou cellule-matrice. L’enregistrement EFP supplémentaire des CSPi-CM humaines permet en outre d’analyser les effets électrophysiologiques induits par le traitement composé, comme l’a montré l’étude CiPA17,19.
Dans la présente étude, des CSPi-CM humaines ont été utilisées, traitées avec de l’épirubicine et de la doxorubicine, toutes deux bien décrites comme des anthracyclines cardiotoxiques, et de l’erlotinib, un inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK) présentant un risque plutôt faible de toxicité cardiovasculaire. L’évaluation chronique avec l’épirubicine, la doxorubicine et l’erlotinib a été réalisée pendant 5 jours. Le résultat montre des changements mineurs dans la contractilité et l’impédance de base lorsque les cellules ont été traitées avec l’erlotinib, mais une diminution toxique dépendante du temps et de la dose de l’amplitude de contraction et de l’impédance de base lorsqu’elles sont traitées avec l’épirubicine et la doxorubicine respectivement. Des mesures aiguës ont été effectuées avec la nifédipine, un bloqueur des canaux calciques, et montrent une diminution de l’amplitude de contraction, de la durée du potentiel de champ et de l’impédance de base, démontrant les effets secondaires cardiotoxiques de ce composé aux niveaux fonctionnel et structurel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le système hybride impédance/EFP/contractilité est une méthodologie complète pour l’évaluation pharmacologique et toxicologique de sécurité à haut débit des passifs cardiaques pour le développement préclinique de médicaments. Il fournit une approche moderne pour les tests de sécurité précliniques sans l’utilisation de modèles animaux, mais avec des capacités de débit plus élevées qui réduisent considérablement le temps et les coûts. Ce système a le potentiel d’être utilisé comme une appro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère fédéral allemand de l’Économie et de l’Action pour le climat (ZIM) et du ministère fédéral allemand de l’Éducation et de la Recherche (KMUinnovativ). Nous remercions FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, États-Unis) d’avoir aimablement fourni des cardiomyocytes et Ncardia B.V. (Leiden, Pays-Bas) d’avoir aimablement fourni des cardiomyocytes, utilisés dans cette étude.
Materials
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
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