Флуоресцентный пожизненный макротомограф для биомедицинских применений
Summary
В этой статье описывается использование нового быстрого оптического тепловизора для макроскопической фотолюминесцентной визуализации образцов с длительным распадом. Описаны процедуры интеграции, получения и анализа изображений, а также подготовка и характеристика материалов датчиков для визуализации и применения тепловизора при изучении биологических образцов.
Abstract
В этой статье представлен новый фотолюминесцентный пожизненный тепловизор, предназначенный для картирования концентрации молекулярного кислорода (O 2) в различных фосфоресцирующих образцах, начиная от твердотельных покрытий, чувствительных к O 2 и заканчивая образцами живых тканей животных, окрашенными растворимыми зондами, чувствительными к O2. В частности, был использован зонд ближнего инфракрасного диапазона NanO2-IR на основе наночастиц, который возбуждается светодиодом (LED) с длиной волны 625 нм и излучает на длине волны 760 нм. Система обработки изображений основана на камере Timepix3 (Tpx3Cam) и оптико-механическом адаптере, в котором также находится усилитель изображения. Микроскопия с фосфоресценцией O2 в течение всего срока службы (PLIM) обычно требуется для различных исследований, но современные платформы имеют ограничения в своей точности, общей гибкости и удобстве использования.
Представленная здесь система представляет собой быстрый и высокочувствительный тепловизор, который построен на интегрированном оптическом датчике и чип-модуле считывания Tpx3Cam. Показано, что он производит высокоинтенсивные сигналы фосфоресценции и стабильные значения времени жизни из окрашенных на поверхности образцов кишечной ткани или внутрипросветно окрашенных фрагментов толстой кишки и позволяет детально картировать уровни O2 в ткани примерно за 20 с или менее. Представлены также первоначальные эксперименты по визуализации гипоксии в трансплантированных опухолях у животных, находящихся в бессознательном состоянии. Мы также описываем, как тепловизор может быть перенастроен для использования с чувствительными к O2 материалами на основе красителей Pt-порфирина, используя светодиод 390 нм для возбуждения и полосовой фильтр 650 нм для излучения. В целом, было обнаружено, что тепловизор PLIM производит точные количественные измерения значений срока службы используемых зондов и соответствующие двумерные карты концентрацииO2 . Он также полезен для метаболической визуализации моделей тканей ex vivo и живых животных.
Introduction
O 2 является одним из ключевых параметров окружающей среды для живых систем, и знание распределения O 2 и его динамики важно для многих биологических исследований 1,2,3. Оценка оксигенации тканей с помощью фосфоресцирующих зондов 4,5,6,7,8 и PLIM 9,10,11,12,13 набирает популярность в биологических и медицинских исследованиях 3,9,14,15,16, 17,18,19. Это связано с тем, что PLIM, в отличие от измерений интенсивности флуоресценции или фосфоресценции, не зависит от внешних факторов, таких как концентрация зонда, фотообесцвечивание, интенсивность возбуждения, оптическое выравнивание, рассеяние и автофлуоресценция.
Однако современные платформы O2 PLIM ограничены своей чувствительностью, скоростью получения изображений, точностью и общим удобством использования. Коррелированный во времени подсчет одиночных фотонов (TCSPC) в сочетании с процедурой растрового сканирования часто используется в устройствах PLIM и флуоресцентной микроскопии с пожизненным отображением (FLIM)20,21,22. Однако, поскольку PLIM требует длительного времени выдержки пикселя (в миллисекундном диапазоне), время получения изображения намного больше, чем требуется для приложений FLIM20,22,23. Другие методы, такие как закрытые ПЗС/КМОП-камеры, не имеют однофотонной чувствительности и имеют низкую частоту кадров20,24,25,26. Более того, существующие PLIM-системы в основном используются в микроскопическом формате, в то время как макроскопические системы менее распространены27.
Макросканер28 PLIM на базе TCSPC был создан для преодоления многих из этих ограничений. Конструкция тепловизора была значительно облегчена за счет использования нового оптико-механического адаптера Cricket, который имеет следующее: i) два адаптера с байонетом C, которые обеспечивают легкое соединение модуля камеры с тыльной стороны и объектива с передней стороны; ii) внутренний корпус для ЭОП и розетка для последнего на внешней стороне сверчка; iii) внутреннее пространство за передним адаптером C-mount, где перед усилителем может быть размещен стандартный эмиссионный фильтр диаметром 25 мм; и iv) встроенная светоколлиматорная оптика с кольцевыми регуляторами, которые обеспечивают оптическое выравнивание/фокусировку между объективом и камерой для получения четких изображений на чипе камеры.
В собранном тепловизоре модуль камеры соединен с задней стороной адаптера Cricket, в котором также находится усилитель изображения, состоящий из фотокатода, за которым следуют микроканальная пластина (MCP), усилитель и быстрый сцинтиллятор, люминофор P47. Внутри Cricket установлен эмиссионный фильтр с длиной волны 760 нм ± 50 нм, а объектив NMV-50M11” прикреплен к переднему адаптеру C-mount. Наконец, объектив и камера оптически выровнены с помощью кольцевых регуляторов.
Роль усилителя заключается в обнаружении входящих фотонов и преобразовании их в быстрые вспышки света на чипе камеры, которые регистрируются и используются для генерации затуханий излучения и изображений времени жизни. Модуль камеры включает в себя усовершенствованную матрицу оптических датчиков на основе TCSPC (256 пикселей x 256 пикселей) и чип считывания нового поколения 29,30,31,32,33, которые позволяют одновременно записывать время прибытия (TOA) и пороговое время (TOT) фотонных всплесков на каждом пикселе микросхемы изображения с временным разрешением 1,6 нс и скоростью считывания 80 Мпиксель/с.
В такой конфигурации камера с усилителем имеет однофотонную чувствительность. Он управляется данными и основан на системе34 быстрого считывания детектора пикселей (SPIDR). Пространственное разрешение тепловизора ранее характеризовалось планарными фосфоресцирующими датчиками O2 и маской разрешающей пластины. Функция отклика прибора (IRF) измерялась путем визуализации планарного флуоресцентного датчика при тех же настройках, которые использовались для всех других измерений. Время жизни красителя около 2,6 нс было достаточно коротким, чтобы его можно было использовать для измерения IRF в режиме PLIM. Тепловизор может отображать объекты размером до 18 мм x 18 мм с пространственным и временным разрешением 39,4 мкм и 30,6 нс (полная ширина при полумаксимуме) соответственно28.
Следующие протоколы описывают сборку макротепловизора и его последующее использование для картирования концентрации O 2 в биологических образцах, окрашенных с помощью ранее охарактеризованного зонда O2 ближнего инфракрасного диапазона NanO2-IR35. Зонд представляет собой яркий, фотостойкий, проницаемый для клеток датчик O2 на основе красителя бензопорфирина (PtBP) платины (II). Он возбудим при 625 нм, излучает при 760 нм и обеспечивает надежный оптический ответ на O 2 в физиологическом диапазоне (0% -21% или 0-210 мкМ O2). Также продемонстрировано, что тепловизор характеризует различные сенсорные материалы на основе Pt(II)-порфириновых красителей. В целом, тепловизор компактный и гибкий, похожий на обычную фотографическую камеру. В текущей конфигурации тепловизор подходит для различных широкопольных PLIM-приложений. Замена светодиода быстрым лазерным источником еще больше улучшит производительность тепловизора и потенциально может позволить наносекундные приложения FLIM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Приведенные выше протоколы дают подробное описание сборки нового тепловизора и его работы в микросекундном режиме FLIM/PLIM. Камера нового поколения Tpx3Cam на базе TCSPC в сочетании с оптико-механическим адаптером Cricket с усилителем изображения, эмиссионным фильтром и макрообъективом создает с…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансовая поддержка этой работы со стороны Научного фонда Ирландии, грантов SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 и 18/SP/3522, а также Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) с благодарностью признается.
Materials
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
References
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
- Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
- Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors – IMCS. , 71-72 (2018).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- O’Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
- Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
- Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
- Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
- Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
- Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
- Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
- Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
- Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).
- Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
- Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
- Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
- Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging – Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B., Becker, W. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. , 225-247 (2015).
- Becker, W., König, K. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. , 23-52 (2018).
- Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800 (2017).
- Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).
- Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).
- Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).
- Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. . Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, (2017).
- Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).
- Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
- Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
- Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).
- Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).
- Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).
- Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006 (2020).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
- Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
- Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
- Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).
- Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. Fluorescence lifetime imaging. Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).
