Fluoreszenzlebensdauer-Makro-Imager für biomedizinische Anwendungen
Summary
Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines neuen, schnellen optischen Bildgebungsgeräts für die makroskopische Photolumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von Proben mit langem Zerfall. Die Integrations-, Bildaufnahme- und Analyseverfahren werden ebenso beschrieben wie die Präparation und Charakterisierung der Sensormaterialien für die Bildgebung und die Anwendung des Imagers bei der Untersuchung biologischer Proben.
Abstract
In diesem Artikel wird ein neuer Photolumineszenz-Lifetime-Imager vorgestellt, der entwickelt wurde, um die molekulare Sauerstoffkonzentration (O2) in verschiedenen phosphoreszierenden Proben abzubilden, die vonO2-empfindlichen Festkörperbeschichtungen bis hin zu lebenden tierischen Gewebeproben, die mit löslichenO2-empfindlichen Sonden gefärbt wurden, reichen. Insbesondere wurde die nanopartikelbasierte Nahinfrarotsonde NanO2-IR verwendet, die mit einer 625 nm Leuchtdiode (LED) anregbar ist und bei 760 nm emittiert. Das Bildgebungssystem basiert auf der Timepix3-Kamera (Tpx3Cam) und dem opto-mechanischen Adapter, der auch einen Bildverstärker beherbergt. Die Phosphoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (PLIM) wird häufig für verschiedene Studien benötigt, aber die aktuellen Plattformen haben Einschränkungen in ihrer Genauigkeit, allgemeinen Flexibilität und Benutzerfreundlichkeit.
Bei dem hier vorgestellten System handelt es sich um einen schnellen und hochempfindlichen Imager, der auf einem integrierten optischen Sensor und einem Auslesechip-Modul, Tpx3Cam, aufgebaut ist. Es wird gezeigt, dass es hochintensive Phosphoreszenzsignale und stabile Lebensdauerwerte aus oberflächengefärbten Darmgewebeproben oder intraluminal gefärbten Fragmenten des Dickdarms erzeugt und die detaillierte Kartierung desO2-Spiegels im Gewebe in etwa 20 s oder weniger ermöglicht. Erste Experimente zur Bildgebung von Hypoxie in transplantierten Tumoren bei bewusstlosen Tieren werden ebenfalls vorgestellt. Wir beschreiben auch, wie der Imager für die Verwendungmit O2-empfindlichen Materialien auf Basis von Pt-Porphyrin-Farbstoffen neu konfiguriert werden kann, wobei eine 390-nm-LED für die Anregung und ein 650-nm-Bandpassfilter für die Emission verwendet werden. Insgesamt konnte festgestellt werden, dass der PLIM-Imager genaue quantitative Messungen der Lebensdauerwerte für die verwendeten Sonden und entsprechende zweidimensionale Karten derO2-Konzentration liefert. Es ist auch nützlich für die metabolische Bildgebung von Ex-vivo-Gewebemodellen und lebenden Tieren.
Introduction
O2 ist einer der wichtigsten Umweltparameter für lebende Systeme, und die Kenntnis der Verteilung vonO2 und seiner Dynamik ist für viele biologische Studien wichtig 1,2,3. Die Bestimmung der Sauerstoffversorgung des Gewebes mit Hilfe der phosphoreszierenden Sonden 4,5,6,7,8 und PLIM 9,10,11,12,13 erfreut sich in der biologischen und medizinischen Forschung zunehmender Beliebtheit 3,9,14,15,16, 17,18,19. Dies liegt daran, dass PLIM im Gegensatz zu Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzintensitätsmessungen nicht von externen Faktoren wie Sondenkonzentration, Photobleichung, Anregungsintensität, optischer Ausrichtung, Streuung und Autofluoreszenz beeinflusst wird.
Aktuelle O2 PLIM-Plattformen sind jedoch durch ihre Empfindlichkeit, Bildaufnahmegeschwindigkeit, Genauigkeit und allgemeine Benutzerfreundlichkeit eingeschränkt. Die zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung (TCSPC) in Kombination mit einem Raster-Scanning-Verfahren wird häufig in PLIM- und FLIM-Geräten (Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie) verwendet20,21,22. Da PLIM jedoch eine lange Pixelverweilzeit (im Millisekundenbereich) erfordert, ist die Zeit der Bildaufnahme viel länger als für FLIM-Anwendungen erforderlich 20,22,23. Andere Techniken, wie z. B. geschlossene CCD/CMOS-Kameras, haben keine Einzelphotonenempfindlichkeit und niedrige Bildraten20,24,25,26. Darüber hinaus werden die bestehenden PLIM-Systeme meist im mikroskopischen Format verwendet, während makroskopische Systeme weniger verbreitet sind27.
Der TCSPC-basierte PLIM-Makro-Imager28 wurde eingerichtet, um viele dieser Einschränkungen zu überwinden. Das Design des Imagers wurde durch die Verwendung eines neuen opto-mechanischen Adapters, Cricket, erheblich erleichtert, der über Folgendes verfügt: i) zwei C-Mount-Adapter, die eine einfache Kopplung des Kameramoduls auf der Rückseite und des Objektivs auf der Vorderseite ermöglichen; ii) ein internes Gehäuse für einen Bildverstärker und eine Steckdose für letzteren an der Außenseite der Grille; iii) ein Innenraum hinter dem frontseitigen C-Mount-Adapter, in dem ein Standard-25-mm-Emissionsfilter vor dem Druckübersetzer untergebracht werden kann; und iv) eine eingebaute Lichtkollimationsoptik mit Ringregulatoren, die eine optische Ausrichtung/Fokussierung zwischen dem Objektiv und der Kamera ermöglichen, um gestochen scharfe Bilder auf dem Kamerachip zu erzeugen.
Im zusammengebauten Imager ist das Kameramodul mit der Rückseite des Cricket-Adapters gekoppelt, der auch einen Bildverstärker enthält, der aus einer Photokathode besteht, gefolgt von einer Mikrokanalplatte (MCP), einem Verstärker und einem schnellen Szintillator, P47-Phosphor. Im Inneren des Cricket ist ein 760-nm- ± 50-nm-Emissionsfilter angebracht, und ein Objektiv, NMV-50M11”, ist am vorderseitigen C-Mount-Adapter angebracht. Schließlich werden das Objektiv und die Kamera optisch mit Ringreglern ausgerichtet.
Die Aufgabe des Verstärkers besteht darin, einfallende Photonen zu detektieren und sie in schnelle Lichtblitze auf dem Kamerachip umzuwandeln, die registriert und zur Erzeugung von Emissionszerfällen und Lebensdauerbildern verwendet werden. Das Kameramodul besteht aus einem fortschrittlichen TCSPC-basierten optischen Sensorarray (256 Pixel x 256 Pixel) und einem Auslesechip der neuen Generation 29,30,31,32,33, die die gleichzeitige Aufzeichnung der Ankunftszeit (TOA) undder Zeit über dem Schwellenwert (TOT) von Photonenausbrüchen an jedem Pixel des Bildgebungschips mit einer Zeitauflösung von 1,6 ns und einer Ausleserate von 80 Mpixel/s ermöglichen.
In dieser Konfiguration hat die Kamera mit dem Verstärker eine Einzelphotonenempfindlichkeit. Es ist datengesteuert und basiert auf dem SPIDR-System (Speedy Pixel Detector Readout)34. Die räumliche Auflösung des Imagers wurde zuvor mit planaren phosphoreszierendenO2-Sensoren und einer Auflösungsplattenmaske charakterisiert. Die Instrumentenantwortfunktion (IRF) wurde durch die Abbildung eines planaren Fluoreszenzsensors unter den gleichen Einstellungen wie bei allen anderen Messungen gemessen. Die Lebensdauer des Farbstoffs von rund 2,6 ns war kurz genug, um ihn für die IRF-Messung im PLIM-Modus zu verwenden. Der Imager kann Objekte mit einer Größe von bis zu 18 mm x 18 mm mit räumlichen und zeitlichen Auflösungen von 39,4 μm bzw. 30,6 ns (volle Breite bei halbem Maximum) abbilden.
Die folgenden Protokolle beschreiben den Zusammenbau des Makro-Imagers und seine anschließende Verwendung zur Kartierung der O2-Konzentration in biologischen Proben, die mit der zuvor charakterisierten Nahinfrarot-O2-SondeNanO2-IR 35 gefärbt wurden. Bei der Sonde handelt es sich um eine helle, photostabile, zelldurchlässige O2-Sonde, die auf dem Farbstoff Platin(II)-benzoporphyrin (PtBP) basiert. Es ist bei 625 nm erregbar, emittiert bei 760 nm und bietet eine robuste optische Reaktion auf O2 im physiologischen Bereich (0%-21% oder 0-210 μM vonO2). Der Imager wird auch demonstriert, um verschiedene Sensormaterialien auf Basis von Pt(II)-Porphyrin-Farbstoffen zu charakterisieren. Insgesamt ist der Imager kompakt und flexibel, ähnlich wie eine herkömmliche Fotokamera. Im aktuellen Setup ist der Imager für verschiedene Weitfeld-PLIM-Anwendungen geeignet. Der Ersatz der LED durch eine schnelle Laserquelle wird die Leistung des Imagers weiter verbessern und könnte potenziell FLIM-Anwendungen im Nanosekundenbereich ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die obigen Protokolle geben eine detaillierte Beschreibung des Zusammenbaus des neuen Imagers und seines Betriebs im Mikrosekunden-FLIM/PLIM-Modus. Die TCSPC-basierte Tpx3Cam-Kamera der neuen Generation, die über den opto-mechanischen Adapter Cricket mit dem Bildverstärker, dem Emissionsfilter und dem Makroobjektiv gekoppelt ist, ergibt ein stabiles, kompaktes und flexibles optisches Modul, das einfach zu bedienen ist. Es wurde gezeigt, dass der Imager bei einer Reihe verschiedener Proben und analytischer Aufgaben gut …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die finanzielle Unterstützung für diese Arbeit durch die Science Foundation Ireland, die Zuschüsse SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 und 18/SP/3522 sowie Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) wird dankbar gewürdigt.
Materials
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
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