Fluorescentie Lifetime Macro Imager voor biomedische toepassingen
Summary
Dit artikel beschrijft het gebruik van een nieuwe, snelle optische imager voor de macroscopische fotoluminescentie lifetime imaging van monsters die lang verval uitzenden. De integratie-, beeldacquisitie- en analyseprocedures worden beschreven, samen met de voorbereiding en karakterisering van de sensormaterialen voor de beeldvorming en de toepassing van de imager bij het bestuderen van biologische monsters.
Abstract
Dit artikel presenteert een nieuwe fotoluminescentie lifetime imager ontworpen om de moleculaire zuurstof (O 2) concentratie in verschillende fosforescerende monsters in kaart te brengen, variërend van solid-state, O 2-gevoelige coatings tot levende dierlijke weefselmonsters gekleurd met oplosbare O 2-gevoelige sondes. In het bijzonder werd de op nanodeeltjes gebaseerde nabij-infrarode sonde NanO2-IR gebruikt, die prikkelbaar is met een 625 nm light-emitting diode (LED) en uitzendt bij 760 nm. Het beeldsysteem is gebaseerd op de Timepix3-camera (Tpx3Cam) en de optomechanische adapter, die ook een beeldversterker herbergt. O2 fosforescentie lifetime imaging microscopie (PLIM) is vaak vereist voor verschillende studies, maar de huidige platforms hebben beperkingen in hun nauwkeurigheid, algemene flexibiliteit en bruikbaarheid.
Het hier gepresenteerde systeem is een snelle en zeer gevoelige imager, die is gebouwd op een geïntegreerde optische sensor en uitleeschipmodule, Tpx3Cam. Het is aangetoond dat het fosforescentiesignalen met hoge intensiteit en stabiele levensduurwaarden produceert uit oppervlaktegekleurde darmweefselmonsters of intraluminaal gekleurde fragmenten van de dikke darm en maakt het mogelijk om weefsel O2-niveaus gedetailleerd in kaart te brengen in ongeveer 20 s of minder. Eerste experimenten met de beeldvorming van hypoxie in getransplanteerde tumoren bij bewusteloze dieren worden ook gepresenteerd. We beschrijven ook hoe de imager opnieuw kan worden geconfigureerd voor gebruik met O2-gevoelige materialen op basis van Pt-porfyrinekleurstoffen met behulp van een 390 nm LED voor de excitatie en een bandpass 650 nm filter voor emissie. Over het algemeen bleek de PLIM-imager nauwkeurige kwantitatieve metingen van levensduurwaarden voor de gebruikte sondes en respectieve tweedimensionale kaarten van de O2-concentratie te produceren. Het is ook nuttig voor de metabole beeldvorming van ex vivo weefselmodellen en levende dieren.
Introduction
O 2 is een van de belangrijkste omgevingsparameters voor levende systemen, en kennis van de verdeling van O 2 en zijn dynamiek is belangrijk voor veel biologische studies 1,2,3. De beoordeling van weefseloxygenatie door middel van fosforescerende sondes 4,5,6,7,8 en PLIM 9,10,11,12,13 wint aan populariteit in biologisch en medisch onderzoek 3,9,14,15,16, 17,18,19. Dit komt omdat PLIM, in tegenstelling tot fluorescentie- of fosforescentie-intensiteitsmetingen, niet wordt beïnvloed door externe factoren zoals sondeconcentratie, fotobleaching, excitatie-intensiteit, optische uitlijning, verstrooiing en autofluorescentie.
De huidige O2 PLIM-platforms worden echter beperkt door hun gevoeligheid, beeldacquisitiesnelheid, nauwkeurigheid en algemene bruikbaarheid. Time-correlated single photon counting (TCSPC), gecombineerd met een rasterscanprocedure, wordt vaak gebruikt in PLIM- en fluorescentie-lifetime imaging microscopie (FLIM) -apparaten20,21,22. Omdat PLIM echter een lange pixelverblijftijd vereist (in het millisecondebereik), is de tijd van beeldacquisitie veel langer dan wat vereist is voor FLIM-toepassingen20,22,23. Andere technieken, zoals gated CCD / CMOS-camera’s, missen enkele fotongevoeligheid en hebben lage framesnelheden20,24,25,26. Bovendien worden de bestaande PLIM-systemen meestal gebruikt in het microscopische formaat, terwijl macroscopische systemen minder vaak voorkomen27.
De op TCSPC gebaseerde PLIM-macro-imager28 is opgezet om veel van deze beperkingen te overwinnen. Het ontwerp van de imager werd aanzienlijk vergemakkelijkt door het gebruik van een nieuwe opto-mechanische adapter, Cricket, die het volgende heeft: i) twee C-mount adapters, die een eenvoudige koppeling van de cameramodule aan de achterkant en een objectieflens aan de voorkant bieden; ii) een interne behuizing voor een beeldversterker en een stopcontact voor de laatste aan de buitenzijde van de Krekel; iii) een interne ruimte achter de C-montageadapter aan de voorzijde waar een standaard emissiefilter van 25 mm voor de versterker kan worden ondergebracht; en iv) een ingebouwde lichtbotsende optiek met ringregelaars, die optische uitlijning / scherpstelling tussen de lens en de camera mogelijk maken om scherpe beelden op de camerachip te produceren.
In de geassembleerde imager is de cameramodule gekoppeld aan de achterkant van de Cricket-adapter, die ook een beeldversterker herbergt die bestaat uit een fotokathode gevolgd door een microkanaalplaat (MCP), een versterker en een snelle scintillator, P47-fosfor. Een 760 nm ± 50 nm emissiefilter is gemonteerd in de Cricket en een objectieflens, NMV-50M11”, is bevestigd aan de C-mount adapter aan de voorzijde. Tot slot zijn de lens en de camera optisch uitgelijnd met ringregelaars.
De rol van de versterker is om inkomende fotonen te detecteren en om te zetten in snelle lichtflitsen op de camerachip, die worden geregistreerd en gebruikt om emissieverval en levensduurbeelden te genereren. De cameramodule bestaat uit een geavanceerde TCSPC-gebaseerde optische sensorarray (256 pixels x 256 pixels) en een nieuwe generatie uitleeschip 29,30,31,32,33, die de gelijktijdige registratie van de aankomsttijd (TOA) en de tijd over drempel (TOT) van fotonuitbarstingen bij elke pixel van de beeldchip mogelijk maakt met een tijdresolutie van 1,6 ns en een uitleessnelheid van 80 Mpixel / s.
In deze configuratie heeft de camera met de versterker een enkele fotongevoeligheid. Het is datagedreven en gebaseerd op het speedy pixel detector readout (SPIDR) systeem34. De ruimtelijke resolutie van de imager werd eerder gekarakteriseerd met vlakke fosforescerende O2-sensoren en een resolutieplaatmasker. De instrumentresponsfunctie (IRF) werd gemeten door de beeldvorming van een vlakke fluorescentiesensor onder dezelfde instellingen als voor alle andere metingen. De levensduur van de kleurstof van ongeveer 2,6 ns was kort genoeg om te worden gebruikt voor de IRF-meting in PLIM-modus. De imager kan objecten van maximaal 18 mm x 18 mm groot maken met ruimtelijke en temporele resoluties van respectievelijk 39,4 μm en 30,6 ns (volledige breedte bij half-maximum),28.
De volgende protocollen beschrijven de assemblage van de macro-imager en het daaropvolgende gebruik ervan voor het in kaart brengen van de O 2-concentratie in biologische monsters die zijn gekleurd met de eerder gekarakteriseerde nabij-infrarode O2-sonde, NanO2-IR35. De sonde is een heldere, fotostabiele, celdoorlatende O2-sensing sonde op basis van platina (II) benzoporfyrine (PtBP) kleurstof. Het is prikkelbaar bij 625 nm, zendt uit bij 760 nm en biedt een robuuste optische respons op O 2 in het fysiologische bereik (0% -21% of 0-210 μM van O2). De imager blijkt ook verschillende sensormaterialen te karakteriseren op basis van Pt(II)-porfyrinekleurstoffen. Over het algemeen is de imager compact en flexibel, vergelijkbaar met een gewone fotocamera. In de huidige opzet is de imager geschikt voor verschillende breedveld PLIM-toepassingen. Het vervangen van de LED door een snelle laserbron zal de prestaties van de imager verder verbeteren en kan mogelijk nanoseconde FLIM-toepassingen mogelijk maken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De bovenstaande protocollen geven een gedetailleerde beschrijving van de assemblage van de nieuwe imager en de werking ervan in de microseconde FLIM/PLIM-modus. De TCSPC-gebaseerde nieuwe generatie Tpx3Cam-camera, gekoppeld door middel van de optomechanische adapter Cricket met de beeldversterker, emissiefilter en macrolens, produceert een stabiele, compacte en flexibele optische module die eenvoudig te bedienen is. De imager bleek goed te presteren met een reeks verschillende monsters en analytische taken, waaronder de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiële steun voor dit werk van de Science Foundation Ireland, subsidies SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 en 18/SP/3522, en Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) wordt dankbaar erkend.
Materials
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
References
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
- Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
- Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors – IMCS. , 71-72 (2018).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- O’Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
- Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
- Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
- Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
- Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
- Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
- Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
- Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
- Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).
- Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
- Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
- Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
- Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging – Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B., Becker, W. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. , 225-247 (2015).
- Becker, W., König, K. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. , 23-52 (2018).
- Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800 (2017).
- Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).
- Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).
- Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).
- Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. . Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, (2017).
- Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).
- Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
- Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
- Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).
- Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).
- Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).
- Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006 (2020).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
- Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
- Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
- Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).
- Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. Fluorescence lifetime imaging. Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).
