JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Biyomedikal Uygulamalar için Floresan Ömür Boyu Makro Görüntüleyici

Published: April 07, 2023
doi:
10.3791/64321
, , , , , ,
1School of Biochemistry and Cell Biology,University College Cork, 2Cancer Research@UCC,University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA),The University of Western Australia, 4Physics Department,Brookhaven National Laboratory

Summary

Bu yazıda, uzun bozunma yayan numunelerin makroskopik fotolüminesans ömür boyu görüntülenmesi için yeni, hızlı bir optik görüntüleyicinin kullanımı açıklanmaktadır. Entegrasyon, görüntü toplama ve analiz prosedürleri, görüntüleme için sensör malzemelerinin hazırlanması ve karakterizasyonu ve görüntüleyicinin biyolojik numunelerin incelenmesinde uygulanması ile birlikte açıklanmaktadır.

Abstract

Bu makalede, katı hal, O2’ye duyarlı kaplamalardan çözünür O2’ye duyarlı problarla boyanmış canlı hayvan dokusu örneklerine kadar farklı fosforesan numunelerdeki moleküler oksijen (O2) konsantrasyonunu haritalamak için tasarlanmış yeni bir fotolüminesans ömür boyu görüntüleyici sunulmaktadır. Özellikle, 625 nm ışık yayan diyot (LED) ile uyarılabilen ve 760 nm’de yayılan nanopartikül tabanlı yakın kızılötesi prob NanO2-IR kullanıldı. Görüntüleme sistemi, Timepix3 kameraya (Tpx3Cam) ve aynı zamanda bir görüntü yoğunlaştırıcı barındıran opto-mekanik adaptöre dayanmaktadır. O2 fosforesans ömür boyu görüntüleme mikroskobu (PLIM) çeşitli çalışmalar için yaygın olarak gereklidir, ancak mevcut platformların doğrulukları, genel esneklikleri ve kullanılabilirlikleri konusunda sınırlamaları vardır.

Burada sunulan sistem, entegre bir optik sensör ve okuma çipi modülü olan Tpx3Cam üzerine inşa edilmiş hızlı ve son derece hassas bir görüntüleyicidir. Yüzey lekeli bağırsak dokusu örneklerinden veya kalın bağırsağın intraluminal olarak boyanmış parçalarından yüksek yoğunluklu fosforesans sinyalleri ve stabil ömür değerleri ürettiği gösterilmiştir ve dokuO2 seviyelerinin yaklaşık 20 s veya daha kısa sürede ayrıntılı haritalanmasını sağlar. Bilinçsiz hayvanlarda aşılanmış tümörlerde hipoksi görüntülemeye yönelik ilk deneyler de sunulmuştur. Ayrıca, görüntüleyicinin, uyarma için 390 nm LED ve emisyon için 650 nm bandpass filtre kullanılarak Pt-porfirin boyalarınadayanan O2’ye duyarlı malzemelerle kullanım için nasıl yeniden yapılandırılabileceğini de açıklıyoruz. Genel olarak, PLIM görüntüleyicinin, kullanılan problar veO2 konsantrasyonunun ilgili iki boyutlu haritaları için yaşam boyu değerlerin doğru nicel ölçümlerini ürettiği bulunmuştur. Ayrıca ex vivo doku modellerinin ve canlı hayvanların metabolik görüntülemesi için de yararlıdır.

Introduction

O2, canlı sistemler için anahtar çevresel parametrelerden biridir veO2’nin dağılımı ve dinamikleri hakkında bilgi sahibi olmak birçok biyolojik çalışma için önemlidir 1,2,3. Doku oksijenasyonununfosforlu problar 4,5,6,7,8 ve PLIM 9,10,11,12,13 ile değerlendirilmesi biyolojik ve tıbbi araştırmalarda popülerlik kazanmaktadır 3,9,14,15,16, 17,18,19. Bunun nedeni, PLIM’in, floresan veya fosforesans yoğunluğu ölçümlerinin aksine, prob konsantrasyonu, fotobeyazlatma, uyarma yoğunluğu, optik hizalama, saçılma ve otofloresan gibi dış faktörlerden etkilenmemesidir.

Bununla birlikte, mevcut O2 PLIM platformları hassasiyetleri, görüntü yakalama hızları, doğrulukları ve genel kullanılabilirlikleri ile sınırlıdır. Zaman korelasyonlu tek foton sayımı (TCSPC), raster tarama prosedürü ile birlikte, PLIM ve floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) cihazlarında sıklıkla kullanılır20,21,22. Bununla birlikte, PLIM uzun bir piksel bekleme süresi gerektirdiğinden (milisaniye aralığında), görüntü alma süresi FLIM uygulamaları için gerekenden çok daha uzundur20,22,23. Kapılı CCD / CMOS kameralar gibi diğer teknikler, tek foton hassasiyetinden yoksundur ve düşük kare hızlarına sahiptir20,24,25,26. Ayrıca, mevcut PLIM sistemleri çoğunlukla mikroskobik formatta kullanılırken, makroskobik sistemler daha az yaygındır27.

TCSPC tabanlı PLIM makro görüntüleyici28 , bu sınırlamaların çoğunun üstesinden gelmek için kurulmuştur. Görüntüleyicinin tasarımı, aşağıdakilere sahip yeni bir opto-mekanik adaptör olan Cricket’in kullanılmasıyla büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır: i) arka taraftaki kamera modülünün ve ön taraftaki objektif lensin kolay bağlanmasını sağlayan iki C montaj adaptörü; ii) Kriketin dış tarafında bir görüntü yoğunlaştırıcı için bir iç mahfaza ve ikincisi için bir elektrik prizi; iii) yoğunlaştırıcının önüne standart bir 25 mm emisyon filtresinin yerleştirilebileceği ön taraftaki C-mount adaptörünün arkasındaki bir iç alan; ve iv) kamera çipinde net görüntüler üretmek için lens ve kamera arasında optik hizalama/odaklama sağlayan halka regülatörleri ile optikleri harmanlayan dahili bir ışık.

Birleştirilmiş görüntüleyicide, kamera modülü, bir fotokatottan oluşan bir görüntü yoğunlaştırıcıyı ve ardından bir mikrokanal plakasını (MCP), bir amplifikatör ve hızlı bir sintilatör, P47 fosforu barındıran Kriket adaptörünün arka tarafına bağlanır. Cricket’in içine 760 nm ± 50 nm emisyon filtresi takılmıştır ve ön taraftaki C-mount adaptörüne NMV-50M11 ” objektif bir lens takılmıştır. Son olarak, lens ve kamera halka regülatörleri ile optik olarak hizalanmıştır.

Yoğunlaştırıcının rolü, gelen fotonları tespit etmek ve bunları kamera çipinde emisyon bozunumları ve ömür boyu görüntüler üretmek için kaydedilen ve kullanılan hızlı ışık patlamalarına dönüştürmektir. Kamera modülü, gelişmiş bir TCSPC tabanlı optik sensör dizisi (256 piksel x 256 piksel) veyeni nesil bir okuma çipi 29,30,31,32,33’ten oluşur ve görüntüleme yongasının her pikselinde 1,6 ns zaman çözünürlüğü ve 80 Mpixel/s okuma hızı ile foton patlamalarının varış zamanının (TOA) ve eşik aşımı süresinin (TOT) eşzamanlı olarak kaydedilmesini sağlar.

Bu konfigürasyonda, yoğunlaştırıcılı kamera tek foton hassasiyetine sahiptir. Veriye dayalıdır ve hızlı piksel dedektörü okuma (SPIDR) sistemi34’e dayanır. Görüntüleyicinin uzamsal çözünürlüğü daha önce düzlemsel fosforesanO2 sensörleri ve bir çözünürlük plakası maskesi ile karakterize edildi. Cihaz tepki fonksiyonu (IRF), diğer tüm ölçümlerde kullanılanla aynı ayarlarda düzlemsel bir floresan sensörün görüntülenmesiyle ölçülmüştür. Yaklaşık 2,6 ns’lik boyanın ömrü, PLIM modunda IRF ölçümü için kullanılabilecek kadar kısaydı. Görüntüleyici, sırasıyla 39,4 μm ve 30,6 ns (yarı maksimumda tam genişlik) uzamsal ve zamansal çözünürlüklerle 18 mm x 18 mm boyutlarına kadar nesneleri görüntüleyebilir28.

Aşağıdaki protokoller, makro görüntüleyicinin montajını ve daha önce karakterize edilen yakın kızılötesi O2 probuNanO2-IR 35 ile boyanmış biyolojik numunelerdeO2 konsantrasyonunun haritalanması için daha sonraki kullanımını açıklamaktadır. Prob, platin (II) benzoporfirin (PtBP) boyasına dayanan parlak, fotostabil, hücre geçirgen birO2 algılama probudur. 625 nm’de uyarılabilir, 760 nm’de yayılır ve fizyolojik aralıktaO2’ye sağlam bir optik yanıt sağlar (% 0 -% 21 veya 0-210 μMO2). Görüntüleyicinin ayrıca Pt(II)-porfirin boyalarına dayalı farklı sensör malzemelerini karakterize ettiği gösterilmiştir. Genel olarak, görüntüleyici yaygın bir fotoğraf makinesine benzer şekilde kompakt ve esnektir. Mevcut kurulumda, görüntüleyici farklı geniş alan PLIM uygulamaları için uygundur. LED’in hızlı bir lazer kaynağı ile değiştirilmesi, görüntüleyicinin performansını daha da artıracak ve potansiyel olarak nanosaniye FLIM uygulamalarını etkinleştirebilir.

Protocol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi (2010/63/EU) uyarınca Sağlık Ürünleri Düzenleme Kurumu (HPRA, İrlanda) tarafından verilen izinler altında gerçekleştirilmiş ve University College Cork Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Numune hazırlama Canlı doku örneklerinin ex vivo probu ile boyanmasıEx vivo uygulamalar için, 4 haftalık dişi Balb / c farelerinden ta…

Representative Results

Ex vivo görüntüleme uygulamaları için, dokunun serozal tarafına NanO2-IR probunun topikal uygulaması ile bağırsak dokusunun parçaları boyandı. Daha derin boyama için, probun 1 μL’si lümene enjekte edildi. İkinci durumda, 0.2-0.25 mm kalınlığındaki bağırsak duvarı, probu kameradan korudu. İki boyama işlemi Şekil 2A’da gösterilmiştir. Elde edilen yoğunluk ve PLIM görüntüleri Şekil 2B-G’de<strong…

Discussion

Yukarıdaki protokoller, yeni görüntüleyicinin montajının ve mikrosaniye FLIM/PLIM modunda çalışmasının ayrıntılı bir açıklamasını verir. TCSPC tabanlı yeni nesil Tpx3Cam kamera, görüntü yoğunlaştırıcı, emisyon filtresi ve makro lens ile opto-mekanik adaptör Cricket ile birleştiğinde, kullanımı kolay, kararlı, kompakt ve esnek bir optik modül üretir. Görüntüleyicinin, fosforlu malzemelerin karakterizasyonu ve canlı dokuO2 görüntülemeyi içeren bir dizi farklı numune ve…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

İrlanda Bilim Vakfı’ndan bu çalışma için mali destek, SFI / 12 / RC / 2276_P2, SFI / 17 / RC-PhD / 3484 ve 18 / SP / 3522 ve Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) için minnetle kabul edilmektedir.

Materials

627 nm LED Parts Express Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.
760 ± 50 nm emission filter Edmund Optics 84-788 Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.
Balb/c mice Envigo, UK Balb/c
Black box Thorlabs XE25C9/M
Cricket Adapter Photonis Cricket-2
CT26 cells  ATCC CT26.WT https://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEM Sigma-Aldrich D0697 Other media can also be used
ImageJ Software ImageJ Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen Photonis PP0360EF
Mini dishes Sarstedt 83.3900.300 35 mm diameter 
Mylar plastic film, 75 micron  RS Ireland 785-0795 Othe plastic substrates can also be used
NanO2-IR home-made n/a The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. 
NMV-50M11” 50 mm lens Navitar Other lenses compatibel with C-mount adators can be used
Optical breadboard Thorlabs MB1836
Petri Dishes Sarstedt 82.1472.001 92 mm diameter
Power Supply Tenma 72-10495
Pulse Generator Tenma TGP110
Sophy Amsterdam Scientific Instruments n/z Provided by ASI together with the Tpx3Cam
Tpx3Cam Amsterdam Scientific Instruments TPXCAM
Tri2 Software University of Oxford n/a Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation Stage Thorlabs LT3
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
  2. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
  3. Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
  4. Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors – IMCS. , 71-72 (2018).
  5. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  6. O’Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
  7. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
  8. Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).
  9. Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
  10. Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
  11. Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
  12. Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
  13. Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
  14. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  15. Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).
  16. Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
  17. Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
  18. Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
  19. Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
  20. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging – Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
  21. Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B., Becker, W. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. , 225-247 (2015).
  22. Becker, W., König, K. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. , 23-52 (2018).
  23. Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800 (2017).
  24. Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).
  25. Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).
  26. Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).
  27. Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. . Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, (2017).
  28. Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).
  29. Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
  30. Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
  31. Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).
  32. Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).
  33. Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).
  34. Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).
  35. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  36. Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006 (2020).
  37. Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
  38. Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
  39. Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
  40. Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).
  41. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. Fluorescence lifetime imaging. Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).

Tags

Fluorescence LifetimeMacro ImagerBiomedical ApplicationsPhosphorescence LifetimeOxygen ConcentrationTCSPCCricket AdapterPhotonis PP0360EF Intensifier650 Nm Emission FilterTPX Three-cam Camera Module390 Nm LEDSOFI SoftwareMedipix/Timepix FramesTime Over Threshold
check_url/64321?article_type=t&slug=fluorescence-lifetime-macro-imager-for-biomedical-applications

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sen, R., Zhdanov, A. V., Devoy, C., Tangney, M., Hirvonen, L. M., Nomerotski, A., Papkovsky, D. B. Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (194), e64321, doi:10.3791/64321 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image