Automatisk adskillelse og indsamling af kræftrelaterede stoffer fra kliniske prøver
Summary
Dette papir beskriver anvendelsen af automatiseret udstyr til nemt og effektivt at adskille og indsamle stoffer, såsom cellefrit DNA og cirkulerende tumorceller, fra fuldblod.
Abstract
For nylig er flydende biopsier blevet brugt til at diagnosticere forskellige sygdomme, herunder kræft. Kropsvæsker indeholder mange stoffer, herunder celler, proteiner og nukleinsyrer, der stammer fra normalt væv, men nogle af disse stoffer stammer også fra det syge område. Undersøgelsen og analysen af disse stoffer i kropsvæskerne spiller en afgørende rolle i diagnosen af forskellige sygdomme. Derfor er det vigtigt at adskille de krævede stoffer nøjagtigt, og der udvikles flere teknikker til dette formål.
Vi har udviklet en lab-on-a-disc type enhed og platform ved navn CD-PRIME. Denne enhed er automatiseret og har gode resultater for prøvekontaminering og prøvestabilitet. Desuden har det fordele ved et godt erhvervelsesudbytte, en kort driftstid og høj reproducerbarhed. Afhængigt af hvilken type disk der skal monteres, kan plasma, der indeholder cellefrit DNA, cirkulerende tumorceller, mononukleære celler i perifert blod eller buffy coats, adskilles. Således kan erhvervelsen af en række forskellige materialer, der er til stede i kropsvæskerne, udføres til en række downstream-applikationer, herunder undersøgelse af omics.
Introduction
Tidlig og præcis påvisning af forskellige sygdomme, herunder kræft, er den vigtigste faktor i etableringen af en behandlingsstrategi 1,2,3,4. Især tidlig påvisning af kræft er tæt forbundet med øgede overlevelseschancer for patienten 5,6,7,8. For nylig har flydende biopsier været i søgelyset for tidlig påvisning af kræft. Faste tumorer gennemgår angiogenese og frigiver forskellige stoffer i blodet. Især er cirkulerende DNA’er (ctDNA’er), cirkulerende RNA’er (ctRNA’er), proteiner, vesikler såsom exosomer og cirkulerende tumorceller (CTC’er) fundet i blodet hos kræftpatienter 2,9. Selv om der er forskelle i mængden af disse stoffer, observeres de konsekvent ikke kun i de tidlige stadier, men også i de senere stadier 6,10. Disse individuelle forskelle er imidlertid meget høje; for eksempel er mængden af cellefrit DNA (cfDNA) indeholdende ctDNA mindre end 1.000 ng, og antallet af CTC’er er mindre end 100 ud af 10 ml fuldblod fra kræftpatienter11,12,13. Mange undersøgelser har karakteriseret kræft ved hjælp af disse stoffer, der er til stede i mindre mængder (dvs. cfDNA, ctDNA og CTC’er). For at opnå nøjagtige resultater er det vigtigt nøjagtigt at adskille små mængder stoffer med høj renhed13,14. Konventionelle centrifugeringsmetoder er almindeligt anvendt, men de er vanskelige at håndtere og har lav renhed afhængigt af brugerens færdigheder. Siden opdagelsen af CTC’er er der udviklet flere separationsteknikker, såsom centrifugering eller densitetsseparation, immunoperler og mikrofluidiske metoder. Flere indeslutningsteknikker er blevet udviklet siden opdagelsen af CTC’er. Disse teknikker er imidlertid ofte begrænsede, når det er nødvendigt at isolere celler fra de forskellige chips og membraner, der bruges til at isolere dem15. Mærkningsmetoderne kræver også udstyr såsom FACS, og der er grænser for downstream-processen på grund af mærkning af forurening.
For nylig er brugen af flydende biopsier steget, og der udføres forskellige undersøgelser til tidlig påvisning af kræft. Selv om denne metode er enkel, er der stadig vanskeligheder med downstream-analyse, og forskellige undersøgelser forsøger at overvinde disse vanskeligheder16,17. Derudover kræver mange steder, herunder hospitaler, automatiserede, reproducerbare og metoder med høj renhed, der er praktiske at bruge. Her har vi udviklet et lab-on-a-disc til automatiseret adskillelse af stoffer fra blodprøver efter en flydende biopsi. Disse enheder er baseret på princippet om centrifugering, mikrofluidik og celleindfangning i porestørrelse. Der er tre typer diske: LBx-1 kan erhverve plasma og buffy coat, mens LBx-2 kan erhverve plasma og PBMC fra fuldblod med et volumen på mindre end 10 ml; FAST-auto kan også erhverve CTC’er ved hjælp af en membran, der kan fjernes fra disken. Op til fire af hver disk kan bruges i én kørsel. Frem for alt er fordelen ved denne enhed og metode, at den kan opnå en række kræftafledte stoffer fra den samme prøve ved hjælp af en lille mængde blod. Det betyder, at patientens blod kun skal trækkes én gang. Derudover har det den fordel, at det udelukker fejl på grund af forskelle i blodprøvetagningsperioden. Denne platform er nem at bruge og giver nøjagtige resultater for flydende biopsier og downstream-applikationer. I denne protokol introduceres brugen af enheden og patronen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mængden og koncentrationen af cfDNA og CTC afhænger af individet, stadiet og typen af kræft. Det afhænger også af patientens tilstand 2,4,5,10,20. Især i de tidlige eller precancerøse stadier af kræft er koncentrationerne af kræftrelaterede stoffer meget lave, så der er stor mulighed for, at det ikke kan påvises. Ikke desto mindre har tidlig påvisn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette manuskript blev delvist støttet af Korea Medical Device Development Fund (KMDF, bevillingsnr. RS-2020-KD000019) og Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, bevillingsnr. HI19C0521020020).
Materials
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
