Kanserle İlgili Maddelerin Klinik Örneklerden Otomatik Olarak Ayrılması ve Toplanması
Summary
Bu makalede, hücresiz DNA ve dolaşımdaki tümör hücreleri gibi maddeleri tam kandan kolayca ve verimli bir şekilde ayırmak ve toplamak için otomatik ekipmanın uygulanması açıklanmaktadır.
Abstract
Son zamanlarda, sıvı biyopsiler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkları teşhis etmek için kullanılmıştır. Vücut sıvıları, normal dokulardan kaynaklanan hücreler, proteinler ve nükleik asitler de dahil olmak üzere birçok madde içerir, ancak bu maddelerin bazıları da hastalıklı bölgeden kaynaklanır. Vücut sıvılarındaki bu maddelerin araştırılması ve analizi, çeşitli hastalıkların teşhisinde çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, gerekli maddeleri doğru bir şekilde ayırmak önemlidir ve bu amaçla kullanılmak üzere çeşitli teknikler geliştirilmiştir.
CD-PRIME adlı bir disk üzerinde laboratuvar tipi cihaz ve platform geliştirdik. Bu cihaz otomatiktir ve numune kontaminasyonu ve numune kararlılığı için iyi sonuçlara sahiptir. Ayrıca, iyi bir satın alma verimi, kısa bir çalışma süresi ve yüksek tekrarlanabilirlik avantajlarına sahiptir. Ek olarak, monte edilecek diskin türüne bağlı olarak, hücresiz DNA içeren plazma, dolaşımdaki tümör hücreleri, periferik kan mononükleer hücreleri veya kabarık katlar ayrılabilir. Böylece, vücut sıvılarında bulunan çeşitli malzemelerin elde edilmesi, omiklerin incelenmesi de dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamaları için yapılabilir.
Introduction
Kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların erken ve doğru tespiti, bir tedavi stratejisinin oluşturulmasında en önemli faktördür 1,2,3,4. Özellikle, kanserin erken teşhisi, hastanın 5,6,7,8 sağkalım şansının artmasıyla yakından ilişkilidir. Son zamanlarda, sıvı biyopsiler kanserin erken teşhisi için spot ışığında olmuştur. Solid tümörler anjiyogeneze uğrar ve çeşitli maddeleri kana salgılar. Özellikle kanser hastalarının kanında dolaşımdaki DNA’lar (ctDNA’lar), dolaşımdaki RNA’lar (ctRNA’lar), proteinler, eksozomlar gibi veziküller ve dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC’ler) bulunmuştur 2,9. Bu maddelerin miktarında farklılıklar olmasına rağmen, sadece erken evrelerde değil, sonraki aşamalarda da sürekli olarak gözlenirler 6,10. Bununla birlikte, bu bireysel farklılıklar çok yüksektir; Örneğin, ctDNA içeren hücresiz DNA (cfDNA) miktarı 1.000 ng’den azdır ve CTC’lerin sayısı 10 mL’lik tam kanda 100’den azdır11,12,13. Birçok çalışma, daha az miktarda bulunan bu maddeleri (yani, cfDNA, ctDNA ve CTC’ler) kullanarak kanseri karakterize etmiştir. Doğru sonuçlar elde etmek için, yüksek saflıkta az miktarda maddenin doğru bir şekilde ayrılması önemlidir13,14. Geleneksel santrifüjleme yöntemleri yaygın olarak kullanılır, ancak kullanımı zordur ve kullanıcının becerisine bağlı olarak düşük saflığa sahiptir. CTC’lerin keşfinden bu yana, santrifüjleme veya yoğunluk derecesi ayırma, immünoboncuk ve mikroakışkan yöntemler gibi çeşitli ayırma teknikleri geliştirilmiştir. CTC’lerin keşfinden bu yana çeşitli muhafaza teknikleri geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu teknikler, hücreleri izole etmek için kullanılan çeşitli çiplerden ve zarlardan izole etmek gerektiğinde genellikle sınırlıdır15. Ayrıca, etiketleme yöntemleri FACS gibi ekipmanlar gerektirir ve etiketleme kontaminasyonu nedeniyle çıkış yönündeki prosesin sınırları vardır.
Son zamanlarda, sıvı biyopsilerin kullanımı artmıştır ve kanserin erken teşhisi için çeşitli çalışmalar yapılmaktadır. Bu yöntem basit olmasına rağmen, aşağı akış analizinde hala zorluklar vardır ve çeşitli çalışmalar bu zorlukların üstesinden gelmeye çalışmaktadır16,17. Buna ek olarak, hastaneler de dahil olmak üzere birçok site, kullanımı uygun, otomatik, yeniden üretilebilir ve yüksek saflıkta yöntemler gerektirir. Burada, sıvı biyopsi sonrasında maddelerin kan örneklerinden otomatik olarak ayrılması için bir disk üzerinde laboratuvar geliştirdik. Bu cihazlar santrifüjleme, mikroakışkanlar ve gözenek büyüklüğünde hücre yakalama prensibine dayanmaktadır. Üç tip disk vardır: LBx-1 plazma ve buffy kat elde edebilirken, LBx-2 10 mL’den daha az hacimli tam kandan plazma ve PBMC elde edebilir; FAST-auto, diskten çıkarılabilir bir membran kullanarak CTC’leri de alabilir. Bir çalıştırmada her diskten en fazla dört adet kullanılabilir. Her şeyden önce, bu cihazın ve yöntemin avantajı, az miktarda kan kullanarak aynı numuneden çeşitli kanser kaynaklı maddeler elde edebilmesidir. Bu, hastanın kanının sadece bir kez alınması gerektiği anlamına gelir. Ayrıca kan örnekleme periyodundaki farklılıklardan kaynaklanan hataları dışlama avantajına sahiptir. Bu platformun kullanımı kolaydır ve sıvı biyopsiler ve aşağı akış uygulamaları için doğru sonuçlar sağlar. Bu protokolde, cihazın ve kartuşun kullanımı tanıtılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
CfDNA ve CTC’nin miktarı ve konsantrasyonu kanserin bireyine, evresine ve türüne bağlıdır. Aynı zamanda hastanın durumuna da bağlıdır 2,4,5,10,20. Özellikle, kanserin erken veya kanser öncesi evrelerinde, kanserle ilişkili maddelerin konsantrasyonları çok düşüktür, bu nedenle tespit edilememesi olasılığı yüksektir. Bununla birlikte, er…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu makale kısmen Kore Tıbbi Cihaz Geliştirme Fonu (KMDF, Hibe No. RS-2020-KD000019) ve Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI, Hibe No. HI19C0521020020) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
