Automatische scheiding en verzameling van kankergerelateerde stoffen uit klinische monsters
Summary
Dit artikel beschrijft de toepassing van geautomatiseerde apparatuur om stoffen, zoals celvrij DNA en circulerende tumorcellen, eenvoudig en efficiënt te scheiden en te verzamelen uit volbloed.
Abstract
Onlangs zijn vloeibare biopsieën gebruikt om verschillende ziekten te diagnosticeren, waaronder kanker. Lichaamsvloeistoffen bevatten veel stoffen, waaronder cellen, eiwitten en nucleïnezuren afkomstig uit normale weefsels, maar sommige van deze stoffen zijn ook afkomstig uit het zieke gebied. Het onderzoek en de analyse van deze stoffen in de lichaamsvloeistoffen spelen een cruciale rol bij de diagnose van verschillende ziekten. Daarom is het belangrijk om de vereiste stoffen nauwkeurig te scheiden en worden verschillende technieken ontwikkeld om voor dit doel te worden gebruikt.
We hebben een lab-on-a-disc type apparaat en platform ontwikkeld met de naam CD-PRIME. Dit apparaat is geautomatiseerd en heeft goede resultaten voor monstervervuiling en monsterstabiliteit. Bovendien heeft het voordelen van een goede acquisitieopbrengst, een korte bedrijfstijd en een hoge reproduceerbaarheid. Bovendien kunnen, afhankelijk van het type schijf dat moet worden gemonteerd, plasma met celvrij DNA, circulerende tumorcellen, perifere mononucleaire bloedcellen of buffy-lagen worden gescheiden. Zo kan de verwerving van een verscheidenheid aan materialen die aanwezig zijn in de lichaamsvloeistoffen worden gedaan voor een verscheidenheid aan downstream-toepassingen, waaronder de studie van omics.
Introduction
Vroege en nauwkeurige detectie van verschillende ziekten, waaronder kanker, is de belangrijkste factor bij het vaststellen van een behandelingsstrategie 1,2,3,4. Met name vroege opsporing van kanker hangt nauw samen met verhoogde overlevingskansen voor de patiënt 5,6,7,8. Onlangs hebben vloeibare biopsieën in de schijnwerpers gestaan voor de vroege opsporing van kanker. Solide tumoren ondergaan angiogenese en geven verschillende stoffen af aan het bloed. Met name circulerende DNA’s (ctDNA’s), circulerende RNA’s (ctRNA’s), eiwitten, blaasjes zoals exosomen en circulerende tumorcellen (CTC’s) zijn gevonden in het bloed van kankerpatiënten 2,9. Hoewel er verschillen zijn in de hoeveelheid van deze stoffen, worden ze consequent waargenomen, niet alleen in de vroege stadia, maar ook in de latere stadia 6,10. Deze individuele verschillen zijn echter erg groot; de hoeveelheid celvrij DNA (cfDNA) dat ctDNA bevat, is bijvoorbeeld minder dan 1.000 ng en het aantal CTC’s is minder dan 100 in 10 ml volbloed van kankerpatiënten 11,12,13. Veel studies hebben kanker gekarakteriseerd met behulp van deze stoffen die in kleinere hoeveelheden aanwezig zijn (d.w.z. cfDNA, ctDNA en CTC’s). Om nauwkeurige resultaten te verkrijgen, is het belangrijk om kleine hoeveelheden stoffen met een hoge zuiverheid13,14 nauwkeurig te scheiden. Conventionele centrifugatiemethoden worden vaak gebruikt, maar ze zijn moeilijk te hanteren en hebben een lage zuiverheid, afhankelijk van de vaardigheid van de gebruiker. Sinds de ontdekking van CTC’s zijn verschillende scheidingstechnieken ontwikkeld, zoals centrifugatie of scheiding van dichtheidsgraad, immunokraal en microfluïdische methoden. Sinds de ontdekking van CTC’s zijn er verschillende containmenttechnieken ontwikkeld. Deze technieken zijn echter vaak beperkt wanneer het nodig is om cellen te isoleren van de verschillende chips en membranen die worden gebruikt om ze te isoleren15. Ook vereisen de tagging-methoden apparatuur zoals FACS en zijn er grenzen aan het downstream-proces als gevolg van tagging-verontreiniging.
Onlangs is het gebruik van vloeibare biopsieën toegenomen en worden er verschillende onderzoeken uitgevoerd voor de vroege opsporing van kanker. Hoewel deze methode eenvoudig is, zijn er nog steeds moeilijkheden bij downstream-analyse en verschillende studies proberen deze moeilijkheden te overwinnen 16,17. Bovendien vereisen veel sites, waaronder ziekenhuizen, geautomatiseerde, reproduceerbare en zeer zuivere methoden die gemakkelijk te gebruiken zijn. Hier hebben we een lab-on-a-disc ontwikkeld voor de geautomatiseerde scheiding van stoffen uit bloedmonsters na een vloeibare biopsie. Deze apparaten zijn gebaseerd op het principe van centrifugatie, microfluïdica en celopname ter grootte van een porie. Er zijn drie soorten schijven: LBx-1 kan plasma en buffy coat verkrijgen, terwijl LBx-2 plasma en PBMC kan verkrijgen uit volbloed met een volume van minder dan 10 ml; FAST-auto kan ook CTC’s verkrijgen met behulp van een membraan dat van de schijf kan worden verwijderd. Maximaal vier van elke schijf kunnen in één keer worden gebruikt. Bovenal is het voordeel van dit apparaat en deze methode dat het een verscheidenheid aan van kanker afgeleide stoffen uit hetzelfde monster kan verkrijgen met behulp van een kleine hoeveelheid bloed. Dit betekent dat het bloed van de patiënt slechts één keer hoeft te worden afgenomen. Bovendien heeft het het voordeel dat fouten als gevolg van verschillen in de bloedafnameperiode worden uitgesloten. Dit platform is eenvoudig te gebruiken en biedt nauwkeurige resultaten voor vloeibare biopsieën en downstream-toepassingen. In dit protocol wordt het gebruik van het apparaat en de cartridge geïntroduceerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hoeveelheid en concentratie van cfDNA en CTC hangt af van het individu, het stadium en het type kanker. Het hangt ook af van de toestand van de patiënt 2,4,5,10,20. Met name in de vroege of precancereuze stadia van kanker zijn de concentraties van kankergerelateerde stoffen erg laag, dus er is een grote kans dat het niet kan worden gedetecteerd. Niettemin …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit manuscript werd gedeeltelijk ondersteund door het Korea Medical Device Development Fund (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) en het Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020).
Materials
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
