नैदानिक नमूनों से कैंसर से संबंधित पदार्थों का स्वचालित पृथक्करण और संग्रह
Summary
यह पेपर पूरे रक्त से कोशिका-मुक्त डीएनए और परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं जैसे पदार्थों को आसानी से और कुशलता से अलग करने और एकत्र करने के लिए स्वचालित उपकरणों के आवेदन का वर्णन करता है।
Abstract
हाल ही में, तरल बायोप्सी का उपयोग कैंसर सहित विभिन्न बीमारियों के निदान के लिए किया गया है। शरीर के तरल पदार्थों में कई पदार्थ होते हैं, जिनमें कोशिकाएं, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड शामिल हैं जो सामान्य ऊतकों से उत्पन्न होते हैं, लेकिन इनमें से कुछ पदार्थ रोगग्रस्त क्षेत्र से भी उत्पन्न होते हैं। शरीर के तरल पदार्थों में इन पदार्थों की जांच और विश्लेषण विभिन्न बीमारियों के निदान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसलिए, आवश्यक पदार्थों को सटीक रूप से अलग करना महत्वपूर्ण है, और इस उद्देश्य के लिए उपयोग किए जाने के लिए कई तकनीकें विकसित की गई हैं।
हमने सीडी-प्राइम नाम से लैब-ऑन-ए-डिस्क टाइप का डिवाइस और प्लेटफॉर्म विकसित किया है। यह डिवाइस स्वचालित है और नमूना संदूषण और नमूना स्थिरता के लिए अच्छे परिणाम हैं। इसके अलावा, इसमें एक अच्छी अधिग्रहण उपज, एक कम ऑपरेशन समय और उच्च प्रजनन क्षमता के फायदे हैं। इसके अलावा, चढ़ाई जाने वाली डिस्क के प्रकार के आधार पर, सेल-मुक्त डीएनए युक्त प्लाज्मा, परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाएं, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं, या बफी कोट अलग किए जा सकते हैं। इस प्रकार, शरीर के तरल पदार्थों में मौजूद विभिन्न प्रकार की सामग्रियों का अधिग्रहण विभिन्न प्रकार के डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें ओमिक्स का अध्ययन भी शामिल है।
Introduction
कैंसर सहित विभिन्न बीमारियों की प्रारंभिक और सटीक पहचान, उपचार रणनीति 1,2,3,4 स्थापित करने में सबसे महत्वपूर्ण कारक है। विशेष रूप से, कैंसर का प्रारंभिक पता लगाने से रोगी के लिए जीवित रहने की संभावना बढ़ जाती है 5,6,7,8। हाल ही में, तरल बायोप्सी कैंसर की शुरुआती पहचान के लिए सुर्खियों में रही है। ठोस ट्यूमर एंजियोजेनेसिस से गुजरते हैं और रक्त में विभिन्न पदार्थों को छोड़ते हैं। विशेष रूप से,कैंसर रोगियों के रक्त में परिसंचारी डीएनए (सीटीडीएनए), परिसंचारी आरएनए (सीटीआरएनए), प्रोटीन, पुटिका जैसे एक्सोसोम, और परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाएं (सीटीसी) पाई गई हैं। यद्यपि इन पदार्थों की मात्रा में अंतर हैं, वे लगातार न केवल शुरुआती चरणों में बल्कि बाद केचरणों 6,10 में भी देखे जाते हैं। हालांकि, ये व्यक्तिगत अंतर बहुत अधिक हैं; उदाहरण के लिए, सीटीडीएनए युक्त सेल-मुक्त डीएनए (सीएफडीएनए) की मात्रा 1,000 एनजी से कम है, और सीटीसी की संख्या कैंसर रोगियों 11,12,13 से पूरे रक्त के10 एमएल में 100 से कम है। कई अध्ययनों ने कम मात्रा में मौजूद इन पदार्थों (यानी, सीएफडीएनए, सीटीडीएनए और सीटीसी) का उपयोग करके कैंसर की विशेषता बताई है। सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए, उच्च शुद्धता वाले पदार्थों की छोटी मात्रा को सटीक रूप से अलग करना महत्वपूर्ण है13,14। पारंपरिक सेंट्रीफ्यूजेशन विधियों का आमतौर पर उपयोग किया जाता है, लेकिन उन्हें संभालना मुश्किल होता है और उपयोगकर्ता के कौशल के आधार पर कम शुद्धता होती है। सीटीसी की खोज के बाद से, कई पृथक्करण तकनीकों को विकसित किया गया है, जैसे कि सेंट्रीफ्यूजेशन या घनत्व ग्रेड पृथक्करण, इम्यूनोबीड और माइक्रोफ्लुइडिक विधियां। सीटीसी की खोज के बाद से कई रोकथाम तकनीकें विकसित की गई हैं। हालांकि, ये तकनीकें अक्सर सीमित होती हैं जब उन्हें अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न चिप्स और झिल्ली से कोशिकाओं को अलग करना आवश्यक होताहै। इसके अलावा, टैगिंग विधियों को एफएसीएस जैसे उपकरणों की आवश्यकता होती है, और टैगिंग संदूषण के कारण डाउनस्ट्रीम प्रक्रिया की सीमाएं हैं।
हाल ही में, तरल बायोप्सी का उपयोग बढ़ गया है, और कैंसर की शुरुआती पहचान के लिए विभिन्न अध्ययन किए जा रहे हैं। यद्यपि यह विधि सरल है, फिर भी डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में कठिनाइयां हैं, और विभिन्न अध्ययन इन कठिनाइयों को दूर करने का प्रयास कर रहे हैं। इसके अलावा, अस्पतालों सहित कई साइटों को स्वचालित, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उच्च शुद्धता वाले तरीकों की आवश्यकता होती है जो उपयोग करने के लिए सुविधाजनक हैं। यहां, हमने तरल बायोप्सी के बाद रक्त के नमूनों से पदार्थों के स्वचालित पृथक्करण के लिए एक प्रयोगशाला-ऑन-ए-डिस्क विकसित की है। ये उपकरण सेंट्रीफ्यूजेशन, माइक्रोफ्लुइडिक्स और पोर-आकार के सेल कैप्चर के सिद्धांत पर आधारित हैं। डिस्क के तीन प्रकार हैं: एलबीएक्स -1 प्लाज्मा और बफी कोट प्राप्त कर सकता है, जबकि एलबीएक्स -2 10 एमएल से कम की मात्रा के साथ पूरे रक्त से प्लाज्मा और पीबीएमसी प्राप्त कर सकता है; फास्ट-ऑटो एक झिल्ली का उपयोग करके सीटीसी भी प्राप्त कर सकता है जो डिस्क से हटाने योग्य है। प्रत्येक डिस्क के चार तक एक रन में उपयोग किया जा सकता है। इन सबसे ऊपर, इस उपकरण और विधि का लाभ यह है कि यह रक्त की थोड़ी मात्रा का उपयोग करके एक ही नमूने से विभिन्न प्रकार के कैंसर-व्युत्पन्न पदार्थ प्राप्त कर सकता है। इसका मतलब है कि रोगी के रक्त को केवल एक बार खींचने की आवश्यकता है। इसके अलावा, रक्त नमूना अवधि में अंतर के कारण त्रुटियों को बाहर करने का लाभ है। यह प्लेटफ़ॉर्म उपयोग करने में आसान है और तरल बायोप्सी और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए सटीक परिणाम प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में, डिवाइस और कारतूस का उपयोग पेश किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीएफडीएनए और सीटीसी की मात्रा और एकाग्रता कैंसर के व्यक्ति, चरण और प्रकार पर निर्भर करती है। यह रोगी की स्थिति 2,4,5,10,20 पर भी निर्भर करता है। व?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस पांडुलिपि को कोरिया मेडिकल डिवाइस डेवलपमेंट फंड (केएमडीएफ, ग्रांट नंबर आरएस -2020-केडी000019) और कोरिया स्वास्थ्य उद्योग विकास संस्थान (खिडी, अनुदान संख्या एचआई 19 सी 0521020020) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
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