Automatisk separasjon og innsamling av kreftrelaterte stoffer fra kliniske prøver
Summary
Dette papiret beskriver anvendelsen av automatisert utstyr for enkelt og effektivt å skille og samle stoffer, for eksempel cellefritt DNA og sirkulerende tumorceller, fra fullblod.
Abstract
Nylig har flytende biopsier blitt brukt til å diagnostisere ulike sykdommer, inkludert kreft. Kroppsvæsker inneholder mange stoffer, inkludert celler, proteiner og nukleinsyrer som stammer fra normalt vev, men noen av disse stoffene stammer også fra det syke området. Undersøkelsen og analysen av disse stoffene i kroppsvæskene spiller en sentral rolle i diagnosen av ulike sykdommer. Derfor er det viktig å nøyaktig skille de nødvendige stoffene, og flere teknikker er utviklet for å brukes til dette formålet.
Vi har utviklet en lab-on-a-disc type enhet og plattform kalt CD-PRIME. Denne enheten er automatisert og har gode resultater for prøvekontaminering og prøvestabilitet. Videre har det fordeler med et godt oppkjøpsutbytte, kort driftstid og høy reproduserbarhet. I tillegg, avhengig av hvilken type plate som skal monteres, kan plasma som inneholder cellefritt DNA, sirkulerende tumorceller, perifere mononukleære celler i blodet eller buffy strøk skilles. Dermed kan oppkjøpet av en rekke materialer som er tilstede i kroppsvæskene gjøres for en rekke nedstrøms applikasjoner, inkludert studiet av omics.
Introduction
Tidlig og nøyaktig påvisning av ulike sykdommer, inkludert kreft, er den viktigste faktoren for å etablere en behandlingsstrategi 1,2,3,4. Spesielt er tidlig påvisning av kreft nært knyttet til økte overlevelsessjanser for pasienten 5,6,7,8. Nylig har flytende biopsier vært i søkelyset for tidlig påvisning av kreft. Solide svulster gjennomgår angiogenese og frigjør ulike stoffer i blodet. Spesielt har sirkulerende DNA (ctDNA), sirkulerende RNA (ctRNA), proteiner, vesikler som eksosomer og sirkulerende tumorceller (CTC) blitt funnet i blodet til kreftpasienter 2,9. Selv om det er forskjeller i mengden av disse stoffene, blir de konsekvent observert ikke bare i de tidlige stadiene, men også i de senere stadiene 6,10. Disse individuelle forskjellene er imidlertid svært høye; For eksempel er mengden cellefritt DNA (cfDNA) som inneholder ctDNA mindre enn 1000 ng, og antall CTC er mindre enn 100 i 10 ml fullblod fra kreftpasienter11,12,13. Mange studier har karakterisert kreft ved hjelp av disse stoffene som er tilstede i mindre mengder (dvs. cfDNA, ctDNA og CTC). For å oppnå nøyaktige resultater er det viktig å nøyaktig skille små mengder stoffer med høy renhet13,14. Konvensjonelle sentrifugeringsmetoder brukes ofte, men de er vanskelige å håndtere og har lav renhet avhengig av brukerens dyktighet. Siden oppdagelsen av CTC har flere separasjonsteknikker blitt utviklet, for eksempel sentrifugering eller tetthetsgradseparasjon, immunobead og mikrofluidiske metoder. Flere inneslutningsteknikker har blitt utviklet siden oppdagelsen av CTC. Imidlertid er disse teknikkene ofte begrenset når det er nødvendig å isolere celler fra de forskjellige sjetongene og membranene som brukes til å isolere dem15. Merkingsmetodene krever også utstyr som FACS, og det er grenser for nedstrømsprosessen på grunn av merking av forurensning.
Nylig har bruken av flytende biopsier økt, og ulike studier utføres for tidlig påvisning av kreft. Selv om denne metoden er enkel, er det fortsatt vanskeligheter med nedstrømsanalyse, og ulike studier forsøker å overvinne disse vanskelighetene16,17. I tillegg krever mange steder, inkludert sykehus, automatiserte, reproduserbare og høyrene metoder som er praktiske å bruke. Her har vi utviklet en lab-on-a-disc for automatisert separering av stoffer fra blodprøver etter flytende biopsi. Disse enhetene er basert på prinsippet om sentrifugering, mikrofluidikk og porestørrelsescellefangst. Det finnes tre typer plater: LBx-1 kan skaffe seg plasma og buffy frakk, mens LBx-2 kan skaffe plasma og PBMC fra fullblod med et volum på mindre enn 10 ml; FAST-auto kan også skaffe CTC-er ved hjelp av en membran som kan fjernes fra platen. Opptil fire av hver plate kan brukes i ett løp. Fremfor alt er fordelen med denne enheten og metoden at den kan oppnå en rekke kreftavledede stoffer fra samme prøve ved hjelp av en liten mengde blod. Dette betyr at pasientens blod bare trenger å bli trukket en gang. I tillegg har den fordelen av å utelukke feil på grunn av forskjeller i blodprøveperioden. Denne plattformen er enkel å bruke og gir nøyaktige resultater for flytende biopsier og nedstrøms applikasjoner. I denne protokollen introduseres bruken av enheten og kassetten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mengden og konsentrasjonen av cfDNA og CTC avhenger av individ, stadium og type kreft. Det avhenger også av tilstanden til pasienten 2,4,5,10,20. Spesielt i de tidlige eller forstadier av kreft er konsentrasjonene av kreftrelaterte stoffer svært lave, så det er stor mulighet for at det ikke kan oppdages. Likevel har tidlig påvisning en svært positiv effek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette manuskriptet ble delvis støttet av Korea Medical Device Development Fund (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) og Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020).
Materials
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
