Automatische Trennung und Sammlung von krebsrelevanten Substanzen aus klinischen Proben
Summary
Dieser Artikel beschreibt die Anwendung automatisierter Geräte zur einfachen und effizienten Trennung und Sammlung von Substanzen, wie z. B. zellfreier DNA und zirkulierenden Tumorzellen, aus Vollblut.
Abstract
In jüngster Zeit wurden Flüssigbiopsien verwendet, um verschiedene Krankheiten, einschließlich Krebs, zu diagnostizieren. Körperflüssigkeiten enthalten viele Substanzen, einschließlich Zellen, Proteine und Nukleinsäuren, die aus normalem Gewebe stammen, aber einige dieser Substanzen stammen auch aus dem erkrankten Bereich. Die Untersuchung und Analyse dieser Substanzen in den Körperflüssigkeiten spielt eine zentrale Rolle bei der Diagnose verschiedener Erkrankungen. Daher ist es wichtig, die erforderlichen Substanzen genau zu trennen, und es werden mehrere Techniken entwickelt, die zu diesem Zweck verwendet werden können.
Wir haben ein Lab-on-a-Disc-Gerät und eine Plattform namens CD-PRIME entwickelt. Dieses Gerät ist automatisiert und hat gute Ergebnisse für die Probenkontamination und Probenstabilität. Darüber hinaus hat es die Vorteile einer guten Erfassungsausbeute, einer kurzen Betriebszeit und einer hohen Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus können je nach Art der zu montierenden Scheibe Plasma mit zellfreier DNA, zirkulierenden Tumorzellen, peripheren mononukleären Blutzellen oder Buffy-Coats getrennt werden. So kann die Erfassung einer Vielzahl von Materialien, die in den Körperflüssigkeiten vorhanden sind, für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen, einschließlich der Untersuchung von Omics, erfolgen.
Introduction
Die frühzeitige und genaue Erkennung verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs, ist der wichtigste Faktor bei der Festlegung einer Behandlungsstrategie 1,2,3,4. Insbesondere die Früherkennung von Krebs steht in engem Zusammenhang mit erhöhten Überlebenschancen für den Patienten 5,6,7,8. In jüngster Zeit stehen Flüssigbiopsien für die Früherkennung von Krebs im Rampenlicht. Solide Tumoren durchlaufen eine Angiogenese und setzen verschiedene Substanzen in das Blut frei. Insbesondere zirkulierende DNA (ctDNAs), zirkulierende RNAs (ctRNAs), Proteine, Vesikel wie Exosomen und zirkulierende Tumorzellen (CTCs) wurden im Blut von Krebspatienten gefunden 2,9. Obwohl es Unterschiede in der Menge dieser Substanzen gibt, werden sie nicht nur in den frühen Stadien, sondern auch in den späteren Stadien konsequent beobachtet 6,10. Diese individuellen Unterschiede sind jedoch sehr hoch; Zum Beispiel beträgt die Menge an zellfreier DNA (cfDNA), die ctDNA enthält, weniger als 1.000 ng und die Anzahl der CTCs weniger als 100 in 10 ml Vollblut von Krebspatienten11,12,13. Viele Studien haben Krebs mit diesen Substanzen charakterisiert, die in geringeren Mengen vorhanden sind (d.h. cfDNA, ctDNA und CTCs). Um genaue Ergebnisse zu erhalten, ist es wichtig, kleine Mengen von Substanzen mit hoher Reinheit13,14 genau zu trennen. Konventionelle Zentrifugationsmethoden werden häufig verwendet, aber sie sind schwierig zu handhaben und haben je nach Geschicklichkeit des Benutzers eine geringe Reinheit. Seit der Entdeckung von CTCs wurden verschiedene Trenntechniken entwickelt, wie z. B. Zentrifugation oder Dichtegradtrennung, Immunbead und mikrofluidische Methoden. Seit der Entdeckung von CTCs wurden mehrere Containment-Techniken entwickelt. Diese Techniken sind jedoch oft begrenzt, wenn es notwendig ist, Zellen aus den verschiedenen Chips und Membranen zu isolieren, die verwendet werden, um sie zu isolieren15. Außerdem erfordern die Kennzeichnungsmethoden Geräte wie FACS, und dem nachgelagerten Prozess sind aufgrund der Markierungskontamination Grenzen gesetzt.
In letzter Zeit hat der Einsatz von Flüssigbiopsien zugenommen, und es werden verschiedene Studien zur Früherkennung von Krebs durchgeführt. Obwohl diese Methode einfach ist, gibt es immer noch Schwierigkeiten bei der nachgelagerten Analyse, und verschiedene Studien versuchen, diese Schwierigkeiten zu überwinden16,17. Darüber hinaus benötigen viele Standorte, einschließlich Krankenhäuser, automatisierte, reproduzierbare und hochreine Methoden, die bequem zu bedienen sind. Hier haben wir ein Lab-on-a-Disc für die automatisierte Trennung von Substanzen aus Blutproben nach einer Flüssigbiopsie entwickelt. Diese Geräte basieren auf dem Prinzip der Zentrifugation, Mikrofluidik und porengroßen Zellerfassung. Es gibt drei Arten von Bandscheiben: LBx-1 kann Plasma und Buffy-Coat aufnehmen, während LBx-2 Plasma und PBMC aus Vollblut mit einem Volumen von weniger als 10 ml aufnehmen kann. FAST-auto kann CTCs auch mit einer Membran erfassen, die von der Scheibe abnehmbar ist. Bis zu vier Stück pro Disc können in einem Durchlauf verwendet werden. Der Vorteil dieses Geräts und dieser Methode besteht vor allem darin, dass sie mit einer geringen Menge Blut eine Vielzahl von krebserregenden Substanzen aus derselben Probe gewinnen kann. Das bedeutet, dass dem Patienten nur einmal Blut abgenommen werden muss. Darüber hinaus hat es den Vorteil, dass Fehler aufgrund von Unterschieden in der Blutentnahmezeit ausgeschlossen werden. Diese Plattform ist einfach zu bedienen und liefert genaue Ergebnisse für Flüssigbiopsien und nachgelagerte Anwendungen. In diesem Protokoll wird die Verwendung des Geräts und der Patrone eingeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Menge und Konzentration von cfDNA und CTC hängt vom Individuum, dem Stadium und der Art des Krebses ab. Es hängt auch vom Zustand des Patientenab 2,4,5,10,20. Insbesondere in den frühen oder präkanzerösen Stadien von Krebs sind die Konzentrationen krebsrelevanter Substanzen sehr gering, so dass eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie nicht nach…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Manuskript wurde teilweise vom Korea Medical Device Development Fund (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) und dem Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020) unterstützt.
Materials
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
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