Automatisk separation och insamling av cancerrelaterade ämnen från kliniska prover
Summary
Detta dokument beskriver tillämpningen av automatiserad utrustning för att enkelt och effektivt separera och samla ämnen, såsom cellfritt DNA och cirkulerande tumörceller, från helblod.
Abstract
Nyligen har flytande biopsier använts för att diagnostisera olika sjukdomar, inklusive cancer. Kroppsvätskor innehåller många ämnen, inklusive celler, proteiner och nukleinsyror som härrör från normala vävnader, men några av dessa ämnen härstammar också från det sjuka området. Undersökningen och analysen av dessa ämnen i kroppsvätskorna spelar en avgörande roll vid diagnos av olika sjukdomar. Därför är det viktigt att noggrant separera de erforderliga ämnena, och flera tekniker utvecklas för att användas för detta ändamål.
Vi har utvecklat en lab-on-a-disc-typ av enhet och plattform som heter CD-PRIME. Denna enhet är automatiserad och har goda resultat för provkontaminering och provstabilitet. Dessutom har det fördelar med ett bra förvärvsutbyte, en kort driftstid och hög reproducerbarhet. Dessutom, beroende på vilken typ av skiva som ska monteras, kan plasma som innehåller cellfritt DNA, cirkulerande tumörceller, mononukleära celler i perifert blod eller buffyrockar separeras. Således kan förvärvet av en mängd olika material som finns i kroppsvätskorna göras för en mängd olika nedströmsapplikationer, inklusive studier av omics.
Introduction
Tidig och korrekt upptäckt av olika sjukdomar, inklusive cancer, är den viktigaste faktorn för att upprätta en behandlingsstrategi 1,2,3,4. I synnerhet är tidig upptäckt av cancer nära besläktad med ökade överlevnadschanser för patienten 5,6,7,8. Nyligen har flytande biopsier varit i rampljuset för tidig upptäckt av cancer. Fasta tumörer genomgår angiogenes och släpper ut olika ämnen i blodet. I synnerhet har cirkulerande DNA (ctDNA), cirkulerande RNA (ctRNA), proteiner, vesiklar såsom exosomer och cirkulerande tumörceller (CTC) hittats i blodet hos cancerpatienter 2,9. Även om det finns skillnader i mängden av dessa ämnen, observeras de konsekvent inte bara i de tidiga stadierna utan också i de senare stadierna 6,10. Dessa individuella skillnader är dock mycket höga; till exempel är mängden cellfritt DNA (cfDNA) som innehåller ctDNA mindre än 1 000 ng och antalet CTC är mindre än 100 i 10 ml helblod från cancerpatienter11,12,13. Många studier har karakteriserat cancer med hjälp av dessa ämnen som finns i mindre mängder (dvs cfDNA, ctDNA och CTC). För att få exakta resultat är det viktigt att noggrant separera små mängder ämnen med hög renhet13,14. Konventionella centrifugeringsmetoder används ofta, men de är svåra att hantera och har låg renhet beroende på användarens skicklighet. Sedan upptäckten av CTC har flera separationstekniker utvecklats, såsom centrifugering eller densitetsseparation, immunobead och mikrofluidiska metoder. Flera inneslutningstekniker har utvecklats sedan upptäckten av CTC. Dessa tekniker är emellertid ofta begränsade när det är nödvändigt att isolera celler från de olika chips och membran som används för att isolera dem15. Märkningsmetoderna kräver också utrustning som FACS, och det finns gränser för nedströmsprocessen på grund av märkningskontaminering.
Nyligen har användningen av flytande biopsier ökat, och olika studier genomförs för tidig upptäckt av cancer. Även om denna metod är enkel finns det fortfarande svårigheter med nedströmsanalys, och olika studier försöker övervinna dessa svårigheter16,17. Dessutom kräver många webbplatser, inklusive sjukhus, automatiserade, reproducerbara och högrenhetsmetoder som är praktiska att använda. Här har vi utvecklat ett lab-on-a-disc för automatisk separation av ämnen från blodprover efter en flytande biopsi. Dessa enheter är baserade på principen om centrifugering, mikrofluidik och porstor cellfångst. Det finns tre typer av skivor: LBx-1 kan förvärva plasma och buffy coat, medan LBx-2 kan förvärva plasma och PBMC från helblod med en volym mindre än 10 ml; FAST-auto kan också skaffa CTC med hjälp av ett membran som kan tas bort från skivan. Upp till fyra av varje skiva kan användas i en körning. Framför allt är fördelen med denna enhet och metod att den kan erhålla en mängd olika cancer-härledda ämnen från samma prov med en liten mängd blod. Detta innebär att patientens blod bara behöver dras en gång. Dessutom har det fördelen att utesluta fel på grund av skillnader i blodprovtagningsperioden. Denna plattform är enkel att använda och ger exakta resultat för flytande biopsier och nedströmsapplikationer. I detta protokoll införs användningen av enheten och patronen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mängden och koncentrationen av CFDNA och CTC beror på individen, scenen och typen av cancer. Det beror också på patientens tillstånd 2,4,5,10,20. I synnerhet i de tidiga eller precancerösa stadierna av cancer är koncentrationerna av cancerrelaterade ämnen mycket låga, så det finns en stor möjlighet att det inte kan detekteras. Icke desto mindre har …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta manuskript stöddes delvis av Korea Medical Device Development Fund (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) och Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020).
Materials
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
