High-throughput cardiotoxiciteitsscreening met behulp van volwassen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenmonolagen
Summary
Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) bieden een alternatief voor het gebruik van dieren voor preklinische cardiotoxiciteitsscreening. Een beperking voor de wijdverbreide toepassing van hiPSC-CMs in preklinische toxiciteitsscreening is het onrijpe, foetale fenotype van de cellen. Hier worden protocollen gepresenteerd voor robuuste en snelle rijping van hiPSC-CMs.
Abstract
Door de mens geïnduceerde van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) worden gebruikt om de afhankelijkheid van dieren en dierlijke cellen te vervangen en te verminderen voor preklinische cardiotoxiciteitstests. In tweedimensionale monolaagformaten recapituleren hiPSC-CMs de structuur en functie van de volwassen menselijke hartspiercellen wanneer ze worden gekweekt op een optimale extracellulaire matrix (ECM). Een van menselijke perinatale stamcellen afgeleide ECM (rijpingsinducerende extracellulaire matrix-MECM) rijpt de hiPSC-CM-structuur, functie en metabole toestand in 7 dagen na plating.
Volwassen hiPSC-CM monolayers reageren ook zoals verwacht op klinisch relevante medicijnen, met een bekend risico op het veroorzaken van aritmieën en cardiotoxiciteit. De rijping van hiPSC-CM monolagen was tot nu toe een obstakel voor de wijdverspreide acceptatie van deze waardevolle cellen voor regelgevende wetenschap en veiligheidsscreening. Dit artikel presenteert gevalideerde methoden voor de plating, rijping en high-throughput, functionele fenotypering van hiPSC-CM elektrofysiologische en contractiele functie. Deze methoden zijn van toepassing op in de handel verkrijgbare gezuiverde cardiomyocyten, evenals van stamcellen afgeleide cardiomyocyten die intern worden gegenereerd met behulp van zeer efficiënte, kamerspecifieke differentiatieprotocollen.
De elektrofysiologische functie met hoge doorvoer wordt gemeten met behulp van spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD’s; emissie: 488 nm), calciumgevoelige fluoroforen (CSF’s) of genetisch gecodeerde calciumsensoren (GCaMP6). Een high-throughput optisch mappingapparaat wordt gebruikt voor optische opnames van elke functionele parameter en aangepaste speciale software wordt gebruikt voor elektrofysiologische gegevensanalyse. MECM-protocollen worden toegepast voor medicatiescreening met behulp van een positieve inotroop (isoprenaline) en humane Ether-a-go-go-related gene (hERG) kanaalspecifieke blokkers. Deze middelen zullen andere onderzoekers in staat stellen om met succes volwassen hiPSC-CMs te gebruiken voor high-throughput, preklinische cardiotoxiciteitsscreening, hartmedicatie-werkzaamheidstests en cardiovasculair onderzoek.
Introduction
Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) zijn op internationale schaal gevalideerd en zijn beschikbaar voor in vitro cardiotoxiciteitsscreening1. Zeer zuivere hiPSC-CM’s kunnen in vrijwel onbeperkte aantallen worden gegenereerd, gecryopreserveerd en ontdooid. Bij het replateren reanimeren ze ook en beginnen ze samen te trekken met een ritme dat doet denken aan het menselijk hart 2,3. Opmerkelijk is dat individuele hiPSC-CM’s aan elkaar koppelen en functionele syncytia vormen die als een enkel weefsel kloppen. Tegenwoordig worden hiPSC’s routinematig afgeleid van bloedmonsters van patiënten, zodat elke persoon kan worden weergegeven met behulp van in vitro hiPSC-CM cardiotoxiciteitsscreeningstests 4,5. Dit creëert de mogelijkheid om “Clinical Trials in a Dish” uit te voeren, met een significante vertegenwoordiging uit diverse populaties6.
Een cruciaal voordeel ten opzichte van bestaande benaderingen voor cardiotoxiciteit bij dieren en dierlijke cellen is dat hiPSC-CMs het volledige menselijke genoom gebruiken en een in vitro systeem bieden met genetische overeenkomsten met het menselijk hart. Dit is vooral aantrekkelijk voor farmacogenomica en gepersonaliseerde geneeskunde – het gebruik van hiPSC-CMs voor medicatie en andere therapieontwikkeling zal naar verwachting nauwkeurigere, nauwkeurigere en veiligere medicatievoorschriften opleveren. Inderdaad, tweedimensionale (2D) hiPSC-CM monolayer assays hebben bewezen voorspellend te zijn voor medicatie cardiotoxiciteit, met behulp van een panel van klinisch gebruikte medicijnen met een bekend risico op het veroorzaken van aritmieën 1,7,8,9. Ondanks het enorme potentieel van hiPSC-CMs en de belofte om de ontwikkeling van geneesmiddelen te stroomlijnen en goedkoper te maken, is er een terughoudendheid geweest om deze nieuwe assays10,11,12 te gebruiken.
Tot nu toe is een belangrijke beperking van wijdverspreide acceptatie en acceptatie van hiPSC-CM-screeningstests hun onvolwassen, foetale uiterlijk, evenals hun functie. De kritieke kwestie van hiPSC-CM rijping is besproken en besproken in de wetenschappelijke literatuur ad nauseum13,14,15,16. Evenzo zijn veel benaderingen gebruikt om hiPSC-CM-rijping te bevorderen, waaronder extracellulaire matrix (ECM) manipulaties in 2D-monolagen en de ontwikkeling van 3D-gemanipuleerde hartweefsels (EHT’s)17,18. Op dit moment is er een wijdverbreide overtuiging dat het gebruik van 3D EHT’s een superieure rijping zal bieden ten opzichte van 2D monolayer-gebaseerde benaderingen. 2D-monolagen bieden echter een hogere efficiëntie van celgebruik en meer succes bij het plateren in vergelijking met 3D-EHT’s; 3D EHT’s gebruiken grotere aantallen cellen en vereisen vaak de opname van andere celtypen die de resultaten kunnen verstoren. Daarom ligt de focus in dit artikel op het gebruik van een eenvoudige methode om hiPSC-CMs te rijpen die zijn gekweekt als 2D-monolagen van elektrisch en mechanisch gekoppelde cellen.
Geavanceerde hiPSC-CM rijping kan worden bereikt in 2D monolagen met behulp van een ECM. De 2D-monolagen van hiPSC-CMs kunnen worden gerijpt met behulp van een zachte, flexibele polydimethylsiloxaan coverslip, bedekt met keldermembraanmatrix afgescheiden door een Engelbreth-Holm-Swarm muizensarcoomcel (muis-ECM). In 2016 toonden rapporten aan dat hiPSC-CMs gekweekt op deze zachte ECM-conditie functioneel volwassen werden, met actiepotentiaalgeleidingssnelheden in de buurt van volwassen hartwaarden (~ 50 cm / s)18. Verder vertoonden deze volwassen hiPSC-CM’s vele andere elektrofysiologische kenmerken die doen denken aan het volwassen hart, waaronder hyperpolariseerde rustmembraanpotentiaal en expressie van Kir2.1. Meer recent identificeerden rapporten een van menselijke perinatale stamcellen afgeleide ECM-coating die de structurele rijping van 2D hiPSC-CMsbevordert 19. Hier worden eenvoudig te gebruiken methoden gepresenteerd om structureel volwassen 2D hiPSC-CM monolagen te ontwikkelen voor gebruik in elektrofysiologische schermen met hoge doorvoer. Verder bieden we validatie van een optisch mapping-instrument voor de geautomatiseerde acquisitie en analyse van 2D hiPSC-CM monolayer elektrofysiologische functie, met behulp van spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD’s) en calciumgevoelige sondes en eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende benaderingen voor in vitro cardiotoxiciteitsscreening met behulp van hiPSC-CMs. Een recent artikel over “Best Practices” over het gebruik van hiPSC-CM’s presenteerde de verschillende in vitro assays, hun primaire uitlezingen en, belangrijker nog, de granulariteit van elke assay om de menselijke cardiale elektrofysiologische functie te kwantificeren20. Naast het gebruik van membraandoorborende elektroden, wordt de meest directe meting van de menselijke cardia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk is ondersteund door NIH-subsidies HL148068-04 en R44ES027703-02 (TJH).
Materials
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
- Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
- Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
- Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
- Blinova, ., et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
- da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
- da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
- Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
- Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).
