Criblage de cardiotoxicité à haut débit utilisant des monocouches de cardiomyocytes de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme mature
Summary
Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) offrent une alternative à l’utilisation d’animaux pour le dépistage cardiotoxique préclinique. Une limite à l’adoption généralisée des CSPhi-CM dans le dépistage de la toxicité préclinique est le phénotype immature, semblable au fœtus des cellules. Les protocoles pour une maturation robuste et rapide des CM-HIPSC sont présentés ici.
Abstract
Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches induites humaines (hiPSC-CM) sont utilisés pour remplacer et réduire la dépendance à l’égard des animaux et des cellules animales pour les tests de cardiotoxicité précliniques. Dans des formats monocouches bidimensionnels, les hiPSC-CM récapitulent la structure et la fonction des cellules du muscle cardiaque humain adulte lorsqu’elles sont cultivées sur une matrice extracellulaire optimale (ECM). Une ECM (matrice extracellulaire induisant la maturation-MECM) dérivée de cellules souches périnatales humaines fait mûrir la structure, la fonction et l’état métabolique de l’hiPSC-CM en 7 jours après le placage.
Les monocouches matures d’hiPSC-CM répondent également comme prévu aux médicaments cliniquement pertinents, avec un risque connu de provoquer des arythmies et une cardiotoxicité. La maturation des monocouches hiPSC-CM était un obstacle à l’adoption généralisée de ces cellules précieuses pour la science réglementaire et le dépistage de la sécurité, jusqu’à présent. Cet article présente des méthodes validées pour le placage, la maturation et le phénotypage fonctionnel à haut débit de la fonction électrophysiologique et contractile de l’hiPSC-CM. Ces méthodes s’appliquent aux cardiomyocytes purifiés disponibles dans le commerce, ainsi qu’aux cardiomyocytes dérivés de cellules souches générés en interne à l’aide de protocoles de différenciation hautement efficaces et spécifiques à la chambre.
La fonction électrophysiologique à haut débit est mesurée à l’aide de colorants sensibles à la tension (VSD; émission: 488 nm), de fluorophores sensibles au calcium (LCR) ou de capteurs de calcium génétiquement codés (GCaMP6). Un dispositif de cartographie optique à haut débit est utilisé pour les enregistrements optiques de chaque paramètre fonctionnel, et un logiciel dédié personnalisé est utilisé pour l’analyse des données électrophysiologiques. Les protocoles MECM sont appliqués pour le dépistage des médicaments à l’aide d’un inotrope positif (isoprénaline) et d’un gène humain lié à l’éther (hERG) bloqueur spécifique du canal. Ces ressources permettront à d’autres chercheurs d’utiliser avec succès les CM-HIPSC matures pour le dépistage cardiotoxique préclinique à haut débit, les tests d’efficacité des médicaments cardiaques et la recherche cardiovasculaire.
Introduction
Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC-CM) ont été validés à l’échelle internationale et sont disponibles pour le dépistage de la cardiotoxicité in vitro 1. Les hiPSC-CM très purs peuvent être générés en nombre pratiquement illimité, cryoconservés et décongelés. Lors du replating, ils se réaniment également et commencent à se contracter avec un rythme rappelant le cœur humain 2,3. Remarquablement, les hiPSC-CM individuels se couplent les uns aux autres et forment une syncytie fonctionnelle qui bat comme un seul tissu. De nos jours, les CSPhi sont systématiquement dérivées d’échantillons de sang de patients, de sorte que toute personne peut être représentée à l’aide de tests de cardiotoxicité hiPSC-CM in vitro 4,5. Cela crée l’opportunité d’effectuer des « essais cliniques dans un plat », avec une représentation significative de diverses populations6.
Un avantage essentiel par rapport aux approches existantes de dépistage de la cardiotoxicité animale et cellulaire animale est que les hiPSC-CM utilisent le génome humain complet et offrent un système in vitro présentant des similitudes génétiques avec le cœur humain. Ceci est particulièrement intéressant pour la pharmacogénomique et la médecine personnalisée – l’utilisation de hiPSC-CM pour le développement de médicaments et d’autres thérapies devrait fournir des prescriptions de médicaments plus précises, précises et sûres. En effet, les tests bidimensionnels (2D) hiPSC-CM monocouche se sont avérés prédictifs de la cardiotoxicité des médicaments, en utilisant un panel de médicaments utilisés cliniquement avec un risque connu de provoquer des arythmies 1,7,8,9. Malgré le vaste potentiel des hiPSC-CM et la promesse de rationaliser et de rendre le développement de médicaments moins cher, il y a eu une réticence à utiliser ces nouveaux tests10,11,12.
Jusqu’à présent, l’une des principales limites de l’adoption et de l’acceptation généralisées des tests de dépistage HiPSC-CM est leur apparence immature, semblable à celle du fœtus, ainsi que leur fonction. La question critique de la maturation hiPSC-CM a été examinée et débattue dans la littérature scientifique ad nauseum13,14,15,16. De même, de nombreuses approches ont été utilisées pour promouvoir la maturation hiPSC-CM, y compris les manipulations de la matrice extracellulaire (ECM) dans les monocouches 2D et le développement de tissus cardiaques modifiés en 3D (EHTs)17,18. À l’heure actuelle, il existe une croyance largement répandue selon laquelle l’utilisation de EHT 3D fournira une maturation supérieure par rapport aux approches monocouches 2D. Cependant, les monocouches 2D offrent une plus grande efficacité d’utilisation des cellules et un succès accru dans le placage par rapport aux EHT 3D; Les EHT 3D utilisent un plus grand nombre de cellules et nécessitent souvent l’inclusion d’autres types de cellules qui peuvent confondre les résultats. Par conséquent, dans cet article, l’accent est mis sur l’utilisation d’une méthode simple pour faire mûrir les hiPSC-CM cultivés en tant que monocouches 2D de cellules couplées électriquement et mécaniquement.
La maturation hiPSC-CM avancée peut être réalisée en monocouches 2D à l’aide d’un ECM. Les monocouches 2D des hiPSC-CM peuvent être affinées à l’aide d’une couche de couverture souple et flexible en polydiméthylsiloxane, recouverte d’une matrice membranaire basale sécrétée par une cellule de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de souris). En 2016, des rapports ont montré que les CM-HIPSC cultivés sur cette condition ECM molle ont mûri fonctionnellement, affichant des vitesses de conduction potentielles d’action proches des valeurs cardiaques adultes (~50 cm/s)18. De plus, ces hiPSC-CM matures présentaient de nombreuses autres caractéristiques électrophysiologiques rappelant le cœur adulte, notamment un potentiel membranaire au repos hyperpolarisé et l’expression de Kir2.1. Plus récemment, des rapports ont identifié un revêtement ECM dérivé de cellules souches périnatales humaines qui favorise la maturation structurelle des hiPSC-CMs2D 19. Ici, des méthodes faciles à utiliser sont présentées aux monocouches 2D hiPSC-CM structurellement matures pour une utilisation dans des criblages électrophysiologiques à haut débit. En outre, nous fournissons la validation d’un instrument de cartographie optique pour l’acquisition et l’analyse automatisées de la fonction électrophysiologique monocouche 2D hiPSC-CM, à l’aide de colorants sensibles à la tension (VSD) et de sondes et protéines sensibles au calcium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il existe plusieurs approches différentes pour le dépistage de la cardiotoxicité in vitro à l’aide de hiPSC-CM. Un récent article sur les « meilleures pratiques » sur l’utilisation des CM-HIPSC a présenté les différents tests in vitro , leurs lectures primaires et, surtout, la granularité de chaque essai pour quantifier la fonction électrophysiologique cardiaque humaine20. En plus d’utiliser des électrodes de perçage de membrane, la mesure la plus directe de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions HL148068-04 et R44ES027703-02 (TJH) des NIH.
Materials
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
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