Humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) tilbyr et alternativ til å bruke dyr til preklinisk kardiotoksisitetsscreening. En begrensning for den utbredte adopsjonen av hiPSC-CMs i preklinisk toksisitetsscreening er den umodne, fosterlignende fenotypen til cellene. Her presenteres protokoller for robust og rask modning av hiPSC-CM.
Humane induserte stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) brukes til å erstatte og redusere avhengigheten av dyr og dyreceller for preklinisk kardiotoksisitetstesting. I todimensjonale monolagsformater rekapitulerer hiPSC-CMs strukturen og funksjonen til de voksne menneskelige hjertemuskelcellene når de dyrkes på en optimal ekstracellulær matrise (ECM). En human perinatal stamcelleavledet ECM (modningsinduserende ekstracellulær matriks-MECM) modner hiPSC-CM-strukturen, funksjonen og metabolsk tilstand i 7 dager etter plating.
Modne hiPSC-CM monolayers responderer også som forventet på klinisk relevante medikamenter, med kjent risiko for å forårsake arytmier og kardiotoksisitet. Modningen av hiPSC-CM monolayers var et hinder for den utbredte adopsjonen av disse verdifulle cellene for regulatorisk vitenskap og sikkerhetsscreening, til nå. Denne artikkelen presenterer validerte metoder for plettering, modning og høy gjennomstrømning, funksjonell fenotyping av hiPSC-CM elektrofysiologisk og kontraktil funksjon. Disse metodene gjelder for kommersielt tilgjengelige rensede kardiomyocytter, så vel som stamcelleavledede kardiomyocytter generert internt ved hjelp av svært effektive, kammerspesifikke differensieringsprotokoller.
Elektrofysiologisk funksjon med høy gjennomstrømning måles ved hjelp av enten spenningsfølsomme fargestoffer (VSD; utslipp: 488 nm), kalsiumfølsomme fluoroforer (CSF) eller genetisk kodede kalsiumsensorer (GCaMP6). En optisk kartleggingsenhet med høy gjennomstrømning brukes til optiske opptak av hver funksjonsparameter, og tilpasset dedikert programvare brukes til elektrofysiologisk dataanalyse. MECM-protokoller brukes til medisineringsscreening ved bruk av et positivt inotropt (isoprenalin) og humant Ether-a-go-go-relatert gen (hERG) kanalspesifikke blokkere. Disse ressursene vil gjøre det mulig for andre etterforskere å utnytte modne hiPSC-CMs for høy gjennomstrømning, preklinisk kardiotoksisitetsscreening, hjertemedisineffektivitetstesting og kardiovaskulær forskning.
Humane induserte pluripotente stamcellederiverte kardiomyocytter (hiPSC-CM) er validert på internasjonal skala, og er tilgjengelige for in vitro kardiotoksisitetsscreening1. Svært rene hiPSC-CM-er kan genereres i nesten ubegrenset antall, kryopreserveres og tines. Ved replating gjenoppliver de også og begynner å trekke seg sammen med en rytme som minner om menneskets hjerte 2,3. Bemerkelsesverdig, individuelle hiPSC-CMs par til hverandre og danner funksjonell syncyti som slår som et enkelt vev. I dag er hiPSCs rutinemessig avledet fra pasientens blodprøver, slik at enhver person kan representeres ved hjelp av in vitro hiPSC-CM kardiotoksisitetsscreeningsanalyser 4,5. Dette skaper muligheten til å utføre “Clinical Trials in a Dish”, med betydelig representasjon fra ulike populasjoner6.
En kritisk fordel i forhold til eksisterende kardiotoksisitetsscreeningsmetoder for dyre- og dyreceller er at hiPSC-CMs bruker hele det menneskelige genomet og tilbyr et in vitro-system med genetiske likheter med menneskets hjerte. Dette er spesielt attraktivt for farmakogenomikk og personlig medisin – bruk av hiPSC-CMs for medisinering og annen terapiutvikling antas å gi mer nøyaktige, presise og sikre medisineringsresepter. Faktisk har todimensjonale (2D) hiPSC-CM monolagsanalyser vist seg å være prediktive for kardiotoksisitet av medisiner, ved bruk av et panel av klinisk brukte medisiner med kjent risiko for å forårsake arytmier 1,7,8,9. Til tross for det enorme potensialet til hiPSC-CMs og løftet om å effektivisere og gjøre legemiddelutvikling billigere, har det vært en motvilje mot å bruke disse nye analysene10,11,12.
Hittil er en stor begrensning av utbredt adopsjon og aksept av hiPSC-CM screeninganalyser deres umodne, fosterlignende utseende, så vel som deres funksjon. Det kritiske spørsmålet om hiPSC-CM modning har blitt gjennomgått og debattert i den vitenskapelige litteraturen ad nauseum13,14,15,16. På samme måte har mange tilnærminger blitt brukt for å fremme hiPSC-CM-modning, inkludert ekstracellulær matrise (ECM) manipulasjoner i 2D monolayers og utviklingen av 3D-konstruerte hjertevev (EHTs)17,18. For øyeblikket er det en utbredt oppfatning at bruken av 3D EHT-er vil gi overlegen modning i forhold til 2D monolayer-baserte tilnærminger. Imidlertid gir 2D monolayers en høyere effektivitet av celleutnyttelse og økt suksess i plating sammenlignet med 3D EHT-er; 3D EHT-er bruker større antall celler, og krever ofte inkludering av andre celletyper som kan forvirre resultater. Derfor er fokuset i denne artikkelen på å bruke en enkel metode for å modne hiPSC-CMs dyrket som 2D monolayers av elektrisk og mekanisk koblede celler.
Avansert hiPSC-CM-modning kan oppnås i 2D monolayers ved bruk av en ECM. 2D-monolagene av hiPSC-CMs kan modnes ved hjelp av et mykt, fleksibelt polydimetylsiloksandeksel, belagt med kjellermembranmatrise utskilt av en Engelbreth-Holm-Swarm-musesarkomcelle (mus ECM). I 2016 viste rapporter at hiPSC-CMs dyrket på denne myke ECM-tilstanden modnet funksjonelt, og viste aksjonspotensielle ledningshastigheter nær voksne hjerteverdier (~ 50 cm / s) 18. Videre viste disse modne hiPSC-CMene mange andre elektrofysiologiske egenskaper som minner om det voksne hjertet, inkludert hyperpolarisert hvilemembranpotensial og ekspresjon av Kir2.1. Mer nylig identifiserte rapporter et humant perinatalt stamcelleavledet ECM-belegg som fremmer strukturell modning av 2D hiPSC-CMs19. Her presenteres brukervennlige metoder for strukturelt modne 2D hiPSC-CM monolayers for bruk i elektrofysiologiske skjermer med høy gjennomstrømning. Videre tilbyr vi validering av et optisk kartleggingsinstrument for automatisert innsamling og analyse av 2D hiPSC-CM monolags elektrofysiologisk funksjon, ved bruk av spenningsfølsomme fargestoffer (VSD) og kalsiumfølsomme sonder og proteiner.
Det finnes flere forskjellige tilnærminger til in vitro kardiotoksisitetsscreening ved bruk av hiPSC-CM. En nylig “Best Practices” -artikkel om bruk av hiPSC-CMs presenterte de forskjellige in vitro-analysene , deres primære avlesninger, og viktigere, hver analyses granularitet for å kvantifisere human hjerteelektrofysiologisk funksjon20. I tillegg til å bruke membranpiercingelektroder, leveres det mest direkte målet på human hjerteelektrofysiologisk funksjon av VSD-er. VSD…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av NIH-stipendene HL148068-04 og R44ES027703-02 (TJH).
0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
B27 | Gibco | 17504-044 | |
Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
HBSS | Gibco | 14025-092 | |
iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
Incucyte Zoom | Sartorius | ||
iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
IWP4 | Tocris | 5214 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
Matrigel | Corning | 354234 | |
MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |