Modelo animal de peixe-zebra para o estudo de reações alérgicas em resposta a biomoléculas de saliva de carrapato

Summary

Aqui, o peixe-zebra (Danio rerio) é usado como modelo para estudar reações alérgicas e respostas imunes relacionadas à síndrome alfa-Gal (AGS), avaliando reações alérgicas à saliva de carrapatos e ao consumo de carne de mamíferos.

Abstract

Os carrapatos são artrópodes vetores que causam doenças por transmissão de patógenos e cujas picadas podem estar relacionadas a reações alérgicas que impactam a saúde humana em todo o mundo. Em alguns indivíduos, altos níveis de anticorpos de imunoglobulina E contra o glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) foram induzidos por picadas de carrapatos. As reações anafiláticas mediadas por glicoproteínas e glicolipídios contendo o glicano α-Gal, presentes na saliva do carrapato, estão relacionadas à síndrome alfa-Gal (AGS) ou alergia à carne de mamíferos. O peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se um modelo de vertebrado amplamente utilizado para o estudo de diferentes patologias. Neste estudo, o peixe-zebra foi usado como modelo para o estudo de reações alérgicas em resposta ao consumo de carne de α-Gal e mamíferos porque, assim como os humanos, eles não sintetizam esse glicano. Para isso, foram avaliados os padrões comportamentais e as reações alérgicas do tipo anafilático hemorrágico em resposta ao consumo de saliva do carrapato Ixodes ricinus e carne de mamíferos. Esta abordagem experimental permite a obtenção de dados válidos que suportam o modelo animal do peixe-zebra para o estudo de alergias transmitidas por carrapatos, incluindo a AGS.

Introduction

Os carrapatos são vetores de patógenos causadores de doenças e também são causadores de reações alérgicas, afetando a saúde humana e animal em todo o^mundo1,2. Durante a alimentação do carrapato, biomoléculas presentes na saliva do carrapato, especialmente proteínas e lipídios, facilitam a alimentação desses ectoparasitas, evitando as defesas do hospedeiro³. Algumas biomoléculas salivares com modificações no glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) levam à produção de altos níveis de anticorpos anti-α-Gal IgE após a picada do carrapato, apenas em alguns indivíduos, o que é conhecido como Síndrome de α-Gal (AGS)⁴. Trata-se de uma doença associada à alergia mediada por IgE que pode resultar em anafilaxia a picadas de carrapatos, consumo de carne de mamíferos não primatas e alguns fármacos, como o cetuximabe5. As reações à α-Gal são frequentemente graves e algumas vezes podem ser fatais 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

O α-Gal é encontrado em todos os mamíferos, exceto macacos do Velho Mundo, macacos e humanos que não têm a capacidade de sintetizar α-Gal¹³. Entretanto, patógenos como bactérias e protozoários expressam esse glicano em sua superfície, o que pode induzir a produção de grandes quantidades de anticorpos IgM/IgG anti-α-Gal e pode ser um mecanismo protetor contra esses patógenos^16,17. Entretanto, a produção de anticorpos anti-α-Gal aumenta o risco de desenvolvimento de alergias anti-α-Gal mediadas por IgE ^7,13. Anticorpos naturais anti-α-Gal produzidos em humanos, principalmente dos subtipos IgM/IgG, poderiam estar associados a essa modificação presente em bactérias da microbiota intestinal¹⁶. A AGS pode ser um diagnóstico clínico desafiador, uma vez que o principal método diagnóstico no momento baseia-se na história clínica de reações alérgicas tardias, especialmente associadas a alergias alimentares (isto é, prurido, urticária localizada ou angioedema recorrente à anafilaxia, urticária e sintomas gastrointestinais) e na dosagem de anticorpos IgE anti-α-Gal⁹. Os achados atuais sugerem que a picada de carrapato constitui um dos principais riscos no aparecimento da AGS 18,19, um aumento de 20 vezes ou mais nos níveis de IgE para α-Gal após uma picada de carrapato 19, uma história de picada de carrapato em pacientes com AGS^20,21,22, a existência de anticorpos reativos a antígenos de carrapatos em pacientes com AGS ^19, e que a IgE anti-α-Gal está fortemente relacionada aos níveis de IgE anti-carrapato^19,23, mas mais estudos são necessários para avaliar quais biomoléculas estão realmente envolvidas.

Além disso, outro cenário possível são pacientes que apresentam fortes reações alérgicas a picadas de carrapatos e altos níveis de anticorpos anti-α-Gal IgE, mas são tolerantes ao consumo de carne de mamíferos¹². Portanto, a alergia à carne de mamíferos pode ser um tipo particular de alergia relacionada à picada de carrapato. As principais espécies de carrapatos associadas à AGS incluem Amblyomma americanum (EUA), Amblyomma sculptum (Brasil), Amblyomma testudinarium e Haemaphysalis longicornis (Japão), Ixodes holocyclus (Austrália) e Ixodes ricinus (principal vetor da borreliose de Lyme na Europa)^11,24.

O único modelo que tem sido utilizado para avaliar a produção de IgE relacionada a picadas de carrapatos é o modelo de camundongos geneticamente modificados com o gene para camundongos knocked out de α−1,3-galactosiltransferase (α-Gal KO)^25,26, pois, assim como outros mamíferos^, camundongos também expressam α-Gal em proteínas e lipídios e não produzem IgE para α-Gal. No entanto, o peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo útil para pesquisas biomédicas aplicadas a mamíferos porque compartilha muitas semelhanças anatômicas com mamíferos e, como os humanos, também é incapaz de sintetizar α-Gal. Como o α-Gal não é produzido naturalmente em peixe-zebra, é um modelo acessível, fácil de manipular e permite um alto tamanho de amostra para o estudo de reações alérgicas relacionadas ao α-Gal.

Neste estudo, o zebrafish é utilizado como organismo modelo para caracterizar e descrever reações alérgicas locais, padrões comportamentais e mecanismos moleculares associados à resposta à sensibilização percutânea à saliva do carrapato^26,27 e subsequente consumo de carne de mamíferos. Para este fim, os peixes são expostos à saliva do carrapato por injeção intradérmica e, em seguida, são alimentados com ração para cães, que contém produtos derivados da carne de mamíferos adequados para uso animal que contém α-Gal²⁷, em seguida, possíveis reações alérgicas relacionadas são avaliadas. Este método pode ser aplicado ao estudo de outras biomoléculas relacionadas a processos alérgicos, especialmente aquelas relacionadas à AGS.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Castilla La Mancha sob o estudo “Avaliação da resposta imune à vacina inativada contra M. bovis e desafio com M. marinum no modelo de peixe-zebra número PR-2017-05-12”. Os carrapatos foram obtidos da colônia de laboratório, onde amostras representativas de carrapatos na colônia foram testadas por PCR para patógenos comuns de carrapatos para confirmar a…

Representative Results

O protocolo aqui apresentado é baseado em vários aspectos de experimentos previamentepublicados27,30 e resultados realizados em nosso laboratório onde o modelo do zebrafish é estabelecido e validado para o estudo da AGS e da resposta imune ao α-Gal, pois tanto humanos quanto zebrafish não sintetizam essa molécula13. Este modelo permite caracterizar e avaliar uma variedade de reações alérgicas como resultado da resposta do hospede…

Discussion

O peixe-zebra é um modelo custo-efetivo e de fácil manuseio, que também tem sido uma ferramenta bastante viável para o estudo de mecanismos moleculares da resposta imune, doenças patogênicas, testes de novas drogas e vacinação e proteção contra infecções^33,34,35. O estudo sobre o comportamento do peixe-zebra é útil, uma vez que estudos anteriores descobriram que algumas espécies de peixes permanecem imóveis no fu…

Materials

1.5 mL tube	VWR	525-0990
All Prep DNA/RNA	Qiagen	80284
Aquatics facilities
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Disection set	VWR	631-1279
Dog Food – Red Classic	Acana
ELISA plates-96 well	Thermo Fisher Scientific	10547781
Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal)	Dextra	NGP0203
iScript Reverse Transcription Supermix	Supermix	1708840
Microliter syringes	Hamilton	7638-01
Plate reader	any
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417-50TAB
pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Pipette tip P10	VWR	613-0364
Pipette tip P1000	VWR	613-0359
Premium food tropical fish	DAPC
Sponge Animal Holder			Made from scrap foam
Stereomicroscope	any
Thermal Cycler Real-Time PCR	any
Tricaine methanesulphonate (MS-222)	Sigma	E10521