Визуализация стареющей улитки с помощью флуоресцентной микроскопии со световым листом

Summary

Был разработан световой микроскоп для визуализации и оцифровки всей улитки.

Abstract

Глухота является наиболее распространенным сенсорным нарушением, затрагивающим примерно 5% или 430 миллионов человек во всем мире по данным Всемирной организации здравоохранения¹. Старение или пресбиакузис является основной причиной нейросенсорной тугоухости и характеризуется повреждением волосковых клеток, спиральных ганглиозных нейронов (SGN) и vascularis. Эти структуры находятся в улитке, которая имеет сложную спиралевидную анатомию мембранных тканей, взвешенных в жидкости и окруженных костью. Эти свойства делают технически сложным исследование и количественную оценку гистопатологических изменений. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы разработали световой микроскоп (TSLIM), который может визуализировать и оцифровывать всю улитку, чтобы облегчить изучение структурно-функциональных взаимосвязей во внутреннем ухе. Правильно выровненные последовательные срезы всей улитки приводят к стеку изображений для трехмерного (3D) объемного рендеринга и сегментации отдельных структур для 3D-визуализации и количественного анализа (т. е. длины, ширины, поверхности, объема и количества). Улитки требуют минимальных этапов обработки (фиксация, декальцинация, обезвоживание, окрашивание и оптическая очистка), все из которых совместимы с последующей визуализацией с высоким разрешением с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии. Поскольку все ткани присутствуют в штабелях, каждая структура может быть оценена индивидуально или относительно других структур. Кроме того, поскольку для визуализации используются флуоресцентные зонды, иммуногистохимия и связывание лигандов могут быть использованы для идентификации конкретных структур и их 3D-объема или распределения в улитке. Здесь мы использовали TSLIM для изучения улиток старых мышей, чтобы количественно оценить потерю волосковых клеток и спиральных ганглиозных нейронов. Кроме того, расширенный анализ (например, кластерный анализ) был использован для визуализации локальных сокращений спиральных ганглиозных нейронов в канале Розенталя вдоль его 3D-объема. Эти подходы демонстрируют способность микроскопии TSLIM количественно оценивать структурно-функциональные взаимосвязи внутри улитки и между ними.

Introduction

Улитка является периферическим органом чувств для слуха у млекопитающих. Он имеет сложную спиральную анатомию повторяющихся сенсорных и поддерживающих клеток, которые анатомически специализированы для обнаружения звуковых колебаний и передачи их в мозг для восприятия слуха. Основными сенсорными элементами являются внутренние и внешние волосковые клетки и их иннервирующие нервные волокна, клеточные тела которых составляют спиральный ганглий, который находится в канале Розенталя (рис. 1). Эти сенсорные и нейронные структуры тонотопически расположены таким образом, что высокочастотные звуки преобразуются в кохлеарной базе, а низкочастотные звуки преобразуются в вершине^{улитки 2}. Анатомическая карта распределения этих сенсорных клеток по длине спирали опорной базилярной мембраны называется цитокохлеограммой³ и может быть сопоставлена с потерей слуха в зависимости от частоты, как показано на аудиограмме.

Перепончатый лабиринт улитки, окруженный плотной костью, делает технически сложным исследование более одной улитковой структуры одновременно. Таким образом, обоснование разработки светового микроскопа заключается в том, чтобы получить хорошо выровненные серийные срезы всей улитки, чтобы все кохлеарные структуры можно было исследовать относительно друг друга в 3D-реконструкциях. Voie et ^al.4 и Voie and Spelman⁵ разработали первый световой микроскоп, называемый ортогональным флуоресцентным оптическим микроскопом (OPFOS), для оптического сечения всей улитки. Однако этот микроскоп никогда не был коммерчески разработан; Итак, наша цель состояла в том, чтобы построить микроскоп с легким листом, называемый тонколистовым лазерным микроскопом для визуализации (TSLIM; Рисунок 2). Ранее были опубликованы детали проектирования и конструкции TSLIM⁸. TSLIM внесла несколько улучшений по сравнению с OPFOS, включая использование цифровой камеры при слабом освещении по сравнению с ПЗС-камерой для сбора изображений, оптически закодированные микропозиционеры для точного и воспроизводимого движения образца через световой лист, использование коммерчески доступной, оптически прозрачной камеры для образцов и окрашивание родамина в этанол, а не в очищающий раствор для предотвращения осаждения пятен в ткани. Коммерческие разработки световых микроскопов, таких как SPIM⁶ , были сосредоточены на визуализации с высоким разрешением живых, небольших прозрачных образцов, но не подходят для цельной кохлеарной визуализации, поскольку им не хватает достаточного рабочего расстояния. Обзор развития других световых микроскопов был опубликован Santi⁷. Основное преимущество TSLIM перед другими гистологическими методами исследования улитки заключается в оптическом разрезе тканей для 3D-реконструкции с сохранением целостности образца, чтобы его можно было использовать другими гистологическими методами. Еще одно преимущество визуализации TSLIM заключается в том, что только тонкий световой лист, созданный лазером, подвергается воздействию на ткань по сравнению с воздействием лазера на всю толщину ткани, как в конфокальной микроскопии. Очистка тканей для минимизации рассеяния света и тот факт, что только небольшая часть ткани подвергается воздействию лазера, приводит к минимальному выцветанию флуорохрома (фотообесцвечиванию) при лазерной визуализации светового листа. Однако процесс фиксации, обезвоживания и очищения изменяет морфологию кохлеарных структур и приводит к усадке тканей по сравнению с живой тканью. Фактическая величина происходящей усадки тканей не определялась.

TSLIM был разработан Шейном Джонсоном и восемью немецкими студентами-оптиками (см. Благодарности). Детали конструкции TSLIM были предоставлены Santi et ^al.8 , а сканирующая версия (sTSLIM) – Schröter et ^al.9. TSLIM функционирует как неразрушающий микротома для оптического среза образцов и как микроскоп для сбора 2D-серийных срезов по всей ширине и толщине улитки. TSLIM может отображать как маленькие (мм), так и большие (см), толстые образцы. Линзы устанавливаются на воздухе, что позволяет работать на больших рабочих расстояниях с объективами сбора 1x и 2x на диссекционном микроскопе. Диссекционный микроскоп также имеет зум-оптику, которая позволяет TSLIM разрешать субклеточные и синаптические структуры на клетках. TSLIM оснащен как синим (473 нм), так и зеленым (532 нм) лазером для подсветки, что позволяет использовать различные флуоресцентные зонды для визуализации. Целью TSLIM является создание хорошо выровненных 2D-оптических срезов через целую улитку для полной цифровой реконструкции тканей улитки. Поскольку это флуоресцентный метод, лиганды и иммуногистохимия также могут быть использованы для идентификации специфических кохлеарных структур.

Первоначально цилиндрическая линза использовалась для создания двух противоположных гауссовских световых листов, но она произвела артефакты поглощения. Благодаря работе Келлера и ^др.10 неподвижная цилиндрическая линза была заменена сканирующим гальванометрическим зеркалом для получения светового листа⁹. Кроме того, поскольку центр светового листа является самым тонким в талии луча, 2D-изображения sTSLIM создаются путем сбора композитных столбцов данных по оси X по ширине образца (рис. 3). Этот метод был впервые описан Buytaert и Dircks¹¹. Специальное программное обеспечение TSLIM для управления и сбора изображений было разработано с использованием графической программы для управления прибором. Световой лист проходит через образец и освещает флуоресцентную плоскость внутри ткани. Эта флуоресцентная плоскость проецируется ортогонально через прозрачный образец и собирается с помощью диссекционного микроскопа. Оптически кодированные микропозиционеры позволяют сканировать через талию луча по оси X для сбора одного составного 2D-изображения, а затем микропозиционер по оси Z перемещает образец в более глубокую плоскость внутри ткани для получения стопки последовательных срезированных 2D-изображений (видео 1, рис. 4). Стопка поступательных изображений собирается по всей ширине, толщине и длине улитки, и сшивание изображений не требуется (Видео 2). Стек изображений переносится на другой компьютер и загружается в программу 3D-рендеринга для 3D-реконструкции и количественной оценки. Стопки изображений содержат всю цифровую информацию о морфологии улитки с разрешением микроскопа. Однако, если требуется более высокое разрешение, интактная улитка может быть дополнительно обработана деструктивными гистологическими методами, такими как микротомное сечение, сканирование и просвечивающая электронная микроскопия.

Программа 3D-рендеринга используется для сегментации различных кохлеарных структур для 3D-рендеринга и количественного анализа. Для сегментации каждая структура в каждом 2D-изображении стека прослеживается с помощью разного цвета с помощью графического планшета и пера (рис. 5). На сегодняшний день сегментировано 20 различных кохлеарных структур (рис. 6). После сегментации можно выполнить различные 3D-анализы. Например, программное обеспечение для 3D-рендеринга может виртуально резецировать улитку в любой плоскости вдоль центроида структуры. На видео 3 показано сечение по касательной к кортиевому органу, которое выявляет волосковые клетки по длине базилярной мембраны. Этот процесс сначала требует ручной сегментации интересующей структуры. Затем центроид структуры рассчитывается на основе наименьшего квадратного соответствия сплайн-точек, расположенных вдоль центра структуры от ее основания до вершины, что позволяет приблизить длину структуры (видео 4). Аналогичный процесс, называемый скелетонизацией, может быть использован для визуализации радиальной ширины конструкции по всей ее длине с помощью цветовой карты (Видео 4). Общий объем каждой структуры рассчитывается программой после сегментации, но относительные расстояния также могут быть количественно определены и визуализированы с помощью цветовых карт в программном обеспечении для 3D-рендеринга (рис. 7). Сегментированные структуры также могут быть экспортированы для получения увеличенных изображений твердопластичных моделей (рис. 8). Кроме того, полуавтоматический подсчет ячеек также может быть выполнен с помощью программного обеспечения для 3D-рендеринга (рис. 9). Иммуногистохимия и связывание лигандов могут быть использованы для окрашивания специфических кохлеарных структур, и эти структуры могут быть выделены из других кохлеарных структур для морфометрической оценки, такой как получение цитокохлеограммы (рис. 10). Длина, ширина, поверхность, объем и количество всех кохлеарных структур могут быть определены с помощью 3D-моделей, что делает этот подход идеальным для картирования повреждения улитки с функциональными нарушениями. В частности, повреждение улитки из-за старения, травмы, вызванной шумом, или других повреждений может быть показано и количественно оценено в 3D-кохлеарных реконструкциях из 2D-оптических срезов. После того, как улитка была оцифрована, существует множество алгоритмов визуализации, которые можно использовать для оценки повреждения улитки любой тканью в алитке в анатомическом регистре по отношению к другим тканям улитки.

Protocol

Все процедуры и использование живых животных были рассмотрены и одобрены (идентификатор протокола #2010-38573A) Комитетом по институциональному уходу и использованию Университета Миннесоты (IACUC), а исследователи, использующие этих животных, были тщательно обучены и протестированы ветерина…

Representative Results

Поскольку темой этого специального выпуска является визуализация эффектов старения в улитке, в качестве примеров будут использоваться молодые (3-месячные, HS2479, мышь штамма CBA) и пожилые (23-месячные, мышь штамма HS2521, C57) улитки. Следует отметить, что TSLIM способен визуализировать различные о…

Discussion

Оптическое срезирование с помощью световой листовой микроскопии для исследования кохлеарных структур не является механически разрушительным, как другие более традиционные гистологические методы, и обеспечивает полное цифровое представление кохлеарных структур относительно друг д…

Materials

Amira 3D Rendering Software	ThermoFisher Scientific		Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433
benzyl benzoate (W213810)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Bondic	Bondic		Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada
Ethanol 95% and 100%	University of Minnesota		Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)  (E5134)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
LabVIEW graphical program and Vision	National Instruments		Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504
methyl salicylate (M6742)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Olympus MVX10 dissection microscope	Olympus Corp		Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034
Rhodamine B isothiocynate, (283924)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Starna Flurometer Cell (3-G-20)	Starna Cells		Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423