Het verouderende slakkenhuis in beeld brengen met light-sheet fluorescentiemicroscopie
Summary
Er werd een lichtplaatmicroscoop ontwikkeld om het hele slakkenhuis in beeld te brengen en te digitaliseren.
Abstract
Doofheid is de meest voorkomende zintuiglijke beperking en treft ongeveer 5% of 430 miljoen mensen wereldwijd volgens de Wereldgezondheidsorganisatie1. Veroudering of presbycusis is een primaire oorzaak van perceptief gehoorverlies en wordt gekenmerkt door schade aan haarcellen, spiraalvormige ganglionneuronen (SGN’s) en de stria vascularis. Deze structuren bevinden zich in het slakkenhuis, dat een complexe, spiraalvormige anatomie heeft van vliezige weefsels die in vloeistof zijn gesuspendeerd en omgeven door bot. Deze eigenschappen maken het technisch moeilijk om histopathologische veranderingen te onderzoeken en te kwantificeren. Om aan deze behoefte te voldoen, ontwikkelden we een lichtplaatmicroscoop (TSLIM) die het hele slakkenhuis in beeld kan brengen en digitaliseren om de studie van structuur-functierelaties in het binnenoor te vergemakkelijken. Goed uitgelijnde seriële secties van het hele slakkenhuis resulteren in een stapel afbeeldingen voor driedimensionale (3D) volumeweergave en segmentatie van individuele structuren voor 3D-visualisatie en kwantitatieve analyse (d.w.z. lengte, breedte, oppervlak, volume en aantal). Cochleae vereisen minimale verwerkingsstappen (fixatie, ontkalking, uitdroging, kleuring en optische clearing), die allemaal compatibel zijn met daaropvolgende beeldvorming met hoge resolutie door scanning en transmissie-elektronenmicroscopie. Omdat alle weefsels in de stapels aanwezig zijn, kan elke structuur afzonderlijk of ten opzichte van andere structuren worden beoordeeld. Omdat beeldvorming fluorescerende sondes gebruikt, kunnen immunohistochemie en ligandbinding bovendien worden gebruikt om specifieke structuren en hun 3D-volume of -verdeling binnen het slakkenhuis te identificeren. Hier gebruikten we TSLIM om slakkenhuizen van oude muizen te onderzoeken om het verlies van haarcellen en spiraalvormige ganglionneuronen te kwantificeren. Daarnaast werden geavanceerde analyses (bijv. clusteranalyse) gebruikt om lokale reducties van spiraalvormige ganglionneuronen in het kanaal van Rosenthal langs het 3D-volume te visualiseren. Deze benaderingen tonen het vermogen van TSLIM microscopie aan om structuur-functierelaties binnen en tussen slakkenhuizen te kwantificeren.
Introduction
Het slakkenhuis is het perifere sensorische orgaan voor het gehoor bij zoogdieren. Het heeft een complexe spiraalvormige anatomie van herhalende sensorische en ondersteunende cellen die anatomisch gespecialiseerd zijn om geluidstrillingen te detecteren en deze naar de hersenen door te geven voor de perceptie van het gehoor. De belangrijkste sensorische elementen zijn de binnenste en buitenste haarcellen en hun innervervende zenuwvezels waarvan de cellichamen het spiraalvormige ganglion vormen, dat zich in het kanaal van Rosenthal bevindt (figuur 1). Deze sensorische en neurale structuren zijn tonotopisch zo gerangschikt dat hoogfrequente geluiden worden getransduceerd in de cochleaire basis en laagfrequente geluiden worden getransduceerd in de cochlea apex2. Een anatomische kaart van deze sensorische celverdeling langs de spiraallengte van het ondersteunende basilaire membraan wordt een cytocochleogram3 genoemd en kan worden vergeleken met gehoorverlies als functie van de frequentie zoals afgebeeld in een audiogram.
Het vliezige labyrint van het slakkenhuis, dat is omgeven door dicht bot, maakt het technisch moeilijk om meer dan één cochleaire structuur tegelijk te onderzoeken. Daarom is de reden voor het ontwikkelen van een lichtplaatmicroscoop om goed uitgelijnde seriële secties van het volledige slakkenhuis te produceren, zodat alle cochleaire structuren ten opzichte van elkaar kunnen worden onderzocht in 3D-reconstructies. Voie et al.4 en Voie en Spelman5 ontwierpen de eerste lichtplaatmicroscoop, genaamd orthogonal plane fluorescence optical sectioning (OPFOS) microscoop, om het hele slakkenhuis optisch te snijden. Deze microscoop is echter nooit commercieel ontwikkeld; Ons doel was dus om een lichtplaatmicroscoop te construeren die een thin sheet laser imaging microscope (TSLIM; Figuur 2). De ontwerp- en constructiedetails voor TSLIM zijn eerder gepubliceerd8. TSLIM heeft verschillende verbeteringen aangebracht ten opzichte van de OPFOS, waaronder het gebruik van een digitale camera bij weinig licht versus een CCD-camera voor het verzamelen van afbeeldingen, optisch gecodeerde micropositioners voor nauwkeurige en reproduceerbare beweging van het monster door de lichtplaat, het gebruik van een in de handel verkrijgbare, optisch heldere monsterkamer en Rhodamine-kleuring in ethanol in plaats van in de opruimoplossing om vlekneerslag in het weefsel te voorkomen. Commerciële ontwikkeling van lichtplaatmicroscopen zoals SPIM6 hebben zich gericht op hoge-resolutie beeldvorming van levende, kleine transparante monsters, maar zijn niet geschikt voor hele cochleaire beeldvorming omdat ze onvoldoende werkafstand hebben. Een overzicht van de ontwikkeling van andere lichtplaatmicroscopen werd gepubliceerd door Santi7. Het belangrijkste voordeel van TSLIM ten opzichte van andere histologische methoden om het slakkenhuis te onderzoeken, is het optisch doorsneden van weefsels voor 3D-reconstructie met behoud van de integriteit van het monster, zodat het kan worden gebruikt door andere histologische methoden. Een ander voordeel van TSLIM-beeldvorming is dat alleen een dunne lichtplaat geproduceerd door een laser wordt blootgesteld aan het weefsel, vergeleken met blootstelling van hele weefseldikte aan de laser zoals bij confocale microscopie. Weefselverwijdering om lichtverstrooiing te minimaliseren en het feit dat slechts een klein deel van het weefsel aan de laser wordt blootgesteld, resulteert in minimale fluorochroomvervaging (fotobleaching) met light-sheet laserbeeldvorming. Het proces van fixatie, uitdroging en clearing verandert echter de morfologie van cochleaire structuren en resulteert in weefselkrimp in vergelijking met levend weefsel. De werkelijke hoeveelheid weefselkrimp die optreedt, is niet bepaald.
TSLIM is ontwikkeld door Shane Johnson en acht Duitse studenten optische techniek (zie Dankbetuigingen). TSLIM constructiedetails werden verstrekt door Santi et al.8 en een scanversie (sTSLIM) door Schröter et al.9. TSLIM functioneert als een niet-destructief microtoom om specimens optisch te snijden en als een microscoop om 2D-seriële secties te verzamelen over de volledige breedte en dikte van het slakkenhuis. TSLIM kan zowel kleine (mm) als grote (cm), dikke exemplaren in beeld brengen. Lenzen zijn in de lucht gemonteerd om lange werkafstanden mogelijk te maken met verzamelobjectieven van 1x en 2x op een dissectiemicroscoop. De dissectiemicroscoop heeft ook zoomoptiek waarmee TSLIM subcellulaire en synaptische structuren op cellen kan oplossen. TSLIM is uitgerust met zowel een blauwe (473 nm) als groene (532 nm) laser voor verlichting waarmee een verscheidenheid aan fluorescerende sondes kan worden gebruikt voor beeldvorming. Het doel van TSLIM is om goed uitgelijnde 2D optische secties te produceren door een heel slakkenhuis voor een volledige digitale reconstructie van cochleaire weefsels. Omdat het een fluorescerende methode is, kunnen liganden en immunohistochemie ook worden gebruikt om specifieke cochleaire structuren te identificeren.
Aanvankelijk werd een cilindrische lens gebruikt om twee tegengestelde Gaussische lichtplaten te produceren, maar het produceerde absorptiebeeldartefacten. Door het werk van Keller et al.10 werd de vaste cilindrische lens vervangen door een scanning galvanometer spiegel om het lichtblad9 te produceren. Aangezien het midden van het lichtblad het dunst is bij de taille van de bundel, worden sTSLIM 2D-beelden bovendien geproduceerd door een samenstelling van X-as kolommen met gegevens over de breedte van het monster te verzamelen (figuur 3). Deze methode werd voor het eerst beschreven door Buytaert en Dircks11. TSLIM aangepaste software voor het aansturen en verzamelen van beelden is ontwikkeld met behulp van een grafisch programma voor instrumentbesturing. Het lichtblad reist door het monster en verlicht een fluorescerend vlak in het weefsel. Dit fluorescerende vlak wordt orthogonaal door het transparante monster geprojecteerd en wordt verzameld door een dissectiemicroscoop. Optisch gecodeerde micropositioners maken het mogelijk om door de straaltaille in de X-as te scannen om een enkel samengesteld 2D-beeld te verzamelen en vervolgens verplaatst de Z-as micropositioner het monster naar een dieper vlak in het weefsel om een stapel seriële, doorsnedede 2D-beelden te verkrijgen (Video 1, Figuur 4). Een stapel translationele afbeeldingen wordt verzameld over de gehele breedte, dikte en lengte van het slakkenhuis en het naaien van afbeeldingen is niet vereist (video 2). De afbeeldingsstapel wordt overgebracht naar een andere computer en geladen in een 3D-renderingprogramma voor 3D-reconstructie en kwantificering. De beeldstapels bevatten alle digitale informatie over de morfologie van een slakkenhuis bij de resolutie van de microscoop. Als echter een hogere resolutie vereist is, kan het intacte slakkenhuis verder worden verwerkt door destructieve histologische methoden zoals microtoomsectie, scannen en transmissie-elektronenmicroscopie.
Het 3D-renderingprogramma wordt gebruikt om verschillende cochleaire structuren te segmenteren voor 3D-rendering en kwantitatieve analyse. Voor segmentatie wordt elke structuur in elke 2D-afbeelding van de stapel met een andere kleur overgetrokken door een grafisch tablet en pen (afbeelding 5). Tot op heden zijn 20 verschillende cochleaire structuren gesegmenteerd (figuur 6). Na segmentatie kunnen verschillende 3D-analyses worden uitgevoerd. 3D-renderingsoftware kan bijvoorbeeld het slakkenhuis virtueel resectieren in elk vlak langs het centrum van de structuur. Video 3 toont secties die raken aan het orgaan van Corti, waardoor de haarcellen over de lengte van het basilaire membraan worden onthuld. Dit proces vereist eerst handmatige segmentatie van de structuur van belang. Vervolgens wordt de centroïde van de structuur berekend op basis van de kleinste vierkanten die passen bij splinepunten die langs het midden van de structuur van de basis tot de top zijn geplaatst, waardoor een benadering van de lengte van de structuur mogelijk is (Video 4). Een soortgelijk proces genaamd skeletonisatie kan worden gebruikt om de radiale breedte van de structuur over de lengte te visualiseren met behulp van een kleurenkaart (Video 4). Het totale volume van elke structuur wordt na segmentatie door het programma berekend, maar relatieve afstanden kunnen ook worden gekwantificeerd en gevisualiseerd met kleurenkaarten in een 3D-renderingsoftware (figuur 7). Gesegmenteerde structuren kunnen ook worden geëxporteerd om vergrote, massief-plastic modelweergaven te produceren (figuur 8). Daarnaast kan semi-geautomatiseerde celtelling ook worden uitgevoerd met behulp van 3D-renderingsoftware (figuur 9). Immunohistochemie en ligandbinding kunnen worden gebruikt om specifieke cochleaire structuren te kleuren en deze structuren kunnen worden geïsoleerd van andere cochleaire structuren voor morfometrische beoordeling, zoals het produceren van een cytocochleogram (figuur 10). Lengte, breedte, oppervlak, volume en aantal van alle cochleaire structuren kunnen worden bepaald uit de 3D-modellen, waardoor deze aanpak ideaal is voor het in kaart brengen van cochleaire schade aan functionele beperkingen. In het bijzonder kan cochleaire schade als gevolg van veroudering, door lawaai veroorzaakt trauma of andere beledigingen worden getoond en gekwantificeerd in 3D-cochleaire reconstructies van 2D-optische secties. Zodra een slakkenhuis is gedigitaliseerd, zijn er tal van beeldvormingsalgoritmen die kunnen worden gebruikt om cochleaire schade van elk weefsel in het slakkenhuis in het anatomische register aan andere cochleaire weefsels te beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optische doorsnede door lichtplaatmicroscopie voor onderzoek van cochleaire structuren is niet mechanisch destructief zoals andere meer traditionele histologische methoden, en het biedt een volledig digitaal beeld van cochleaire structuren ten opzichte van elkaar. Eerdere methoden zoals oppervlaktepreparaten van het orgaan van Corti14 leverden een kaart op van haarcelverlies langs de lengte van het basilaire membraan, maar SGN-verlies kon niet worden beoordeeld omdat het weefsel was ontleed om het…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek is ondersteund door subsidies van het National Institute on Deafness and Other Communication Disorders van de National Institutes of Health, de Kellogg Foundation en particuliere donaties van Bridget Sperl en John McCormick. TSLIM is ontwikkeld met de uitstekende hulp van Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg en Julian Wuester van de Technische Universiteit van Illmenau, Duitsland, onder supervisie van hun mentoren (Stefan Sinzinger en Rene Theska) en James Leger.
Materials
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
References
- Deafness and hearing loss. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss (2021)
- Vater, M., Kössl, M. Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals. Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).
- Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. The digital cytocochleogram. Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).
- Voie, A. H., Spelman, S. A. Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections. Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Santi, P. A., et al. Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues. BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).
- Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection. Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039 (2007).
- Spalteholz, W. . On making human and animal preparations transparent. , (1914).
- Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion. Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).
- Santi, P. A. Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry. Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).
- Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model. Hearing Research. 339, 112-124 (2016).
- White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse. Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).
- Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy. Hearing Research. 422, 108533 (2022).
