Imagem da Cóclea Envelhecida com Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz

Summary

Um microscópio fotográfico foi desenvolvido para obter imagens e digitalizar a cóclea inteira.

Abstract

A surdez é a deficiência sensorial mais comum, afetando aproximadamente 5% ou 430 milhões de pessoas no mundo, de acordo com a Organização Mundial da Saúde¹. O envelhecimento ou presbiacusia é uma causa primária de perda auditiva neurossensorial e é caracterizada por danos às células ciliadas, neurônios do gânglio espiral (GNG) e estria vascular. Essas estruturas residem dentro da cóclea, que tem uma anatomia complexa em forma de espiral de tecidos membranosos suspensos em fluido e circundados por osso. Essas propriedades dificultam tecnicamente a investigação e quantificação das alterações histopatológicas. Para suprir essa necessidade, desenvolvemos um microscópio fotográfico (TSLIM) que pode obter imagens e digitalizar toda a cóclea para facilitar o estudo das relações estrutura-função na orelha interna. Seções seriais bem alinhadas de toda a cóclea resultam em uma pilha de imagens para renderização de volume tridimensional (3D) e segmentação de estruturas individuais para visualização 3D e análise quantitativa (ou seja, comprimento, largura, superfície, volume e número). As cócleas requerem etapas mínimas de processamento (fixação, descalcificação, desidratação, coloração e clareamento óptico), todas compatíveis com imagens subsequentes de alta resolução por microscopia eletrônica de varredura e transmissão. Uma vez que todos os tecidos estão presentes nas pilhas, cada estrutura pode ser avaliada individualmente ou em relação a outras estruturas. Além disso, como a imagem utiliza sondas fluorescentes, a imunohistoquímica e a ligação de ligantes podem ser usadas para identificar estruturas específicas e seu volume ou distribuição 3D dentro da cóclea. Aqui usamos TSLIM para examinar cócleas de camundongos idosos para quantificar a perda de células ciliadas e neurônios do gânglio espiral. Além disso, análises avançadas (por exemplo, análise de agrupamento) foram usadas para visualizar reduções locais de neurônios do gânglio espiral no canal de Rosenthal ao longo de seu volume 3D. Essas abordagens demonstram a capacidade da microscopia TSLIM de quantificar as relações estrutura-função dentro e entre as cócleas.

Introduction

A cóclea é o órgão sensorial periférico para a audição em mamíferos. Tem uma anatomia espiral complexa de células sensoriais e de suporte repetidas que são anatomicamente especializadas para detectar vibrações sonoras e transmiti-las ao cérebro para a percepção da audição. Os principais elementos sensoriais são as células ciliadas internas e externas e suas fibras nervosas inervantes, cujos corpos celulares compõem o gânglio espiral, que reside dentro do canal de Rosenthal (Figura 1). Essas estruturas sensoriais e neurais são dispostas tonotopicamente de tal forma que sons de alta frequência são transduzidos na base da cóclea e sons de baixa frequência são transduzidos no ápice da cóclea2. Um mapa anatômico da distribuição dessas células sensoriais ao longo do comprimento espiral da membrana basilar de suporte é chamado de citococleograma³ e pode ser comparado com a perda auditiva em função da frequência retratada em um audiograma.

O labirinto membranoso da cóclea, que é circundado por osso denso, torna tecnicamente difícil examinar mais de uma estrutura coclear ao mesmo tempo. Portanto, a justificativa para o desenvolvimento de um microscópio de folha de luz é produzir cortes seriados bem alinhados da cóclea completa para que todas as estruturas cocleares possam ser examinadas em relação umas às outras em reconstruções 3D. Voie et ^al.4 e Voie e Spelman5 projetaram o primeiro microscópio de folha de luz, chamado microscópio de corte óptico de fluorescência no plano ortogonal (OPFOS), para seccionar opticamente toda a cóclea. No entanto, este microscópio nunca foi desenvolvido comercialmente; assim, nosso objetivo foi construir um microscópio de folha de luz chamado microscópio de imagem a laser de folha fina (TSLIM; Gráfico 2). Os detalhes de projeto e construção do TSLIM foram publicados anteriormente⁸. TSLIM fez várias melhorias sobre o OPFOS, incluindo o uso de uma câmera digital de baixa luz versus uma câmera CCD para coleta de imagens, microposicionadores codificados opticamente para movimento preciso e reprodutível do espécime através da folha de luz, uso de uma câmara de amostra opticamente clara disponível comercialmente e coloração de rodamina em etanol em vez de na solução de limpeza para evitar a precipitação de manchas dentro do tecido. O desenvolvimento comercial de microscópios fotográficos, como o SPIM⁶, tem se concentrado em imagens de alta resolução de espécimes vivos e transparentes pequenos, mas não são adequados para imagens cocleares inteiras por não terem distância de trabalho adequada. Uma revisão do desenvolvimento de outros microscópios de folha de luz foi publicada por Santi⁷. A principal vantagem do TSLIM sobre outros métodos histológicos para examinar a cóclea é a secção óptica dos tecidos para reconstrução 3D, preservando a integridade do espécime para que possa ser usado por outros métodos histológicos. Outra vantagem da imagem TSLIM é que apenas uma fina folha de luz produzida por um laser é exposta ao tecido, em comparação com a exposição de toda a espessura do tecido ao laser como na microscopia confocal. A limpeza do tecido para minimizar a dispersão da luz e o fato de que apenas uma pequena porção do tecido é exposta ao laser resulta em mínimo desbotamento de fluorocromo (fotoclareamento) com imagens a laser de folha de luz. No entanto, o processo de fixação, desidratação e clareamento altera a morfologia das estruturas cocleares e resulta em encolhimento do tecido em comparação com o tecido vivo. A quantidade real de encolhimento tecidual que ocorre não foi determinada.

O TSLIM foi desenvolvido por Shane Johnson e oito estudantes alemães de engenharia óptica (ver Agradecimentos). Os detalhes de construção do TSLIM foram fornecidos por Santi et ^al.8 e uma versão de varredura (sTSLIM) por Schröter et ^al.9. O TSLIM funciona como um micrótomo não destrutivo para seccionar opticamente espécimes e como um microscópio para coletar cortes seriados 2D através de toda a largura e espessura da cóclea. O TSLIM pode obter imagens de espécimes pequenos (mm) e grandes (cm) espécimes espessos. As lentes são montadas a ar para permitir longas distâncias de trabalho com objetivas de coleta de 1x e 2x em um microscópio de dissecção. O microscópio de dissecção também possui zoom óptico que permite ao TSLIM resolver estruturas subcelulares e sinápticas nas células. O TSLIM é equipado com um laser azul (473 nm) e verde (532 nm) para iluminação que permite que uma variedade de sondas fluorescentes sejam usadas para geração de imagens. O objetivo do TSLIM é produzir cortes ópticos 2D bem alinhados através de toda a cóclea para uma reconstrução digital completa dos tecidos cocleares. Por ser um método fluorescente, ligantes e imunohistoquímica também podem ser utilizados para identificar estruturas cocleares específicas.

Inicialmente, uma lente cilíndrica foi usada para produzir duas folhas de luz Gaussiana opostas, mas produziu artefatos de imagem de absorção. Devido ao trabalho de Keller et ^al.10, a lente cilíndrica fixa foi substituída por um espelho galvanômetro de varredura para produzir a folha de luz⁹. Além disso, como o centro da folha de luz é o mais fino na cintura do feixe, as imagens sTSLIM 2D são produzidas coletando uma composição de colunas de dados do eixo X em toda a largura do espécime (Figura 3). Esse método foi descrito pela primeira vez por Buytaert e Dircks¹¹. O software personalizado TSLIM para conduzir e coletar imagens foi desenvolvido usando um programa gráfico para controle de instrumentos. A folha de luz viaja através do espécime e ilumina um plano fluorescente dentro do tecido. Este plano fluorescente é projetado ortogonalmente através do espécime transparente e é coletado por um microscópio de dissecção. Microposicionadores codificados opticamente permitem varrer através da cintura do feixe no eixo X para coletar uma única imagem 2D composta e, posteriormente, o microposicionador do eixo Z move o espécime para um plano mais profundo dentro do tecido para obter uma pilha de imagens 2D seriais seccionadas (Vídeo 1, Figura 4). Uma pilha de imagens translacionais é coletada em toda a largura, espessura e comprimento da cóclea, não sendo necessária a costura das imagens (Vídeo 2). A pilha de imagens é transferida para outro computador e carregada em um programa de renderização 3D para reconstrução e quantificação 3D. As pilhas de imagens contêm todas as informações digitais sobre a morfologia de uma cóclea na resolução do microscópio. No entanto, se uma resolução maior for necessária, a cóclea intacta pode ser processada por métodos histológicos destrutivos, como secção em micrótomos, varredura e microscopia eletrônica de transmissão.

O programa de renderização 3D é usado para segmentar diferentes estruturas cocleares para renderização 3D e análise quantitativa. Para segmentação, cada estrutura em cada imagem 2D da pilha é rastreada usando uma cor diferente por uma mesa gráfica e caneta (Figura 5). Até o momento, 20 diferentes estruturas cocleares foram segmentadas (Figura 6). Após a segmentação, uma variedade de análises 3D pode ser realizada. Por exemplo, o software de renderização 3D pode ressecção virtualmente da cóclea em qualquer plano ao longo do centroide da estrutura. O vídeo 3 mostra a secção tangencial ao órgão de Corti, que revela as células ciliadas ao longo do comprimento da membrana basilar. Esse processo requer primeiramente a segmentação manual da estrutura de interesse. Em seguida, o centroide da estrutura é calculado com base no ajuste dos mínimos quadrados dos pontos spline colocados ao longo do centro da estrutura desde sua base até seu ápice, permitindo assim uma aproximação do comprimento da estrutura (Vídeo 4). Um processo semelhante chamado esqueletonização pode ser usado para visualizar a largura radial da estrutura ao longo de seu comprimento usando um mapa colorido (Vídeo 4). O volume total de cada estrutura é calculado pelo programa após a segmentação, mas as distâncias relativas também podem ser quantificadas e visualizadas com mapas coloridos em um software de renderização 3D (Figura 7). Estruturas segmentadas também podem ser exportadas para produzir renderizações ampliadas de modelos de plástico sólido (Figura 8). Além disso, a contagem semi-automatizada de células também pode ser realizada usando um software de renderização 3D (Figura 9). A imuno-histoquímica e a ligação ao ligante podem ser usadas para corar estruturas cocleares específicas e estas estruturas podem ser isoladas de outras estruturas cocleares para avaliação morfométrica, como a confecção de um citococleograma (Figura 10). O comprimento, a largura, a superfície, o volume e o número de todas as estruturas cocleares podem ser determinados a partir dos modelos 3D, tornando esta abordagem ideal para mapear os danos cocleares e os comprometimentos funcionais. Especificamente, danos cocleares devido ao envelhecimento, trauma induzido por ruído ou outros insultos podem ser mostrados e quantificados em reconstruções cocleares 3D a partir de cortes ópticos 2D. Uma vez que a cóclea foi digitalizada, existem inúmeros algoritmos de imagem que podem ser usados para avaliar o dano coclear de qualquer tecido dentro da cóclea no registro anatômico para outros tecidos cocleares.

Protocol

Todos os procedimentos e o uso de animais vivos foram revisados e aprovados (ID do Protocolo #2010-38573A) pelo Comitê de Cuidados e Uso Institucional da Universidade de Minnesota (IACUC) e os pesquisadores que usam esses animais foram exaustivamente treinados e testados pelos Veterinários de Recursos Animais de Pesquisa (RAR) antes de terem acesso às instalações para animais. Camundongos machos e fêmeas foram utilizados neste estudo. 1. Remoção da cóclea para fixação e proces…

Representative Results

Como o tema deste número especial é a imagem dos efeitos do envelhecimento na cóclea, uma cóclea jovem (camundongo HS2479, cepa CBA) e envelhecida (camundongo HS2521, cepa C57 de 23 meses) será usada como exemplo. Deve-se notar que o TSLIM é capaz de obter imagens de uma variedade de espécimes, incluindo cócleas de humanos, mamíferos, outros roedores e peixes, bem como outros órgãos, como o cérebro. Johnson e col. 13 publicaram um artigo sobre SGNs em camund…

Discussion

O corte óptico por microscopia óptica para exame das estruturas cocleares não é mecanicamente destrutivo como outros métodos histológicos mais tradicionais, e fornece uma visão digital completa das estruturas cocleares em relação umas às outras. Métodos anteriores, como preparações superficiais do órgão de^Corti14 , forneceram um mapa da perda de células ciliadas ao longo do comprimento da membrana basilar, mas a perda de SGN não pôde ser avaliada, uma vez que o tecido havia sido …

Materials

Amira 3D Rendering Software	ThermoFisher Scientific		Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433
benzyl benzoate (W213810)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Bondic	Bondic		Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada
Ethanol 95% and 100%	University of Minnesota		Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)  (E5134)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
LabVIEW graphical program and Vision	National Instruments		Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504
methyl salicylate (M6742)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Olympus MVX10 dissection microscope	Olympus Corp		Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034
Rhodamine B isothiocynate, (283924)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Starna Flurometer Cell (3-G-20)	Starna Cells		Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423