Avbildning av den aldrende cochlea med lysarkfluorescensmikroskopi

Summary

Et lysarkmikroskop ble utviklet for å avbilde og digitalisere hele sneglehuset.

Abstract

Døvhet er den vanligste sensoriske svekkelsen, som påvirker omtrent 5% eller 430 millioner mennesker over hele verden i henhold til Verdens helseorganisasjon¹. Aldring eller presbycusis er en primær årsak til sensorineural hørselstap og er preget av skade på hårceller, spiral ganglion nevroner (SGN), og stria vaskularis. Disse strukturene ligger i cochlea, som har en kompleks, spiralformet anatomi av membranøse vev suspendert i væske og omgitt av bein. Disse egenskapene gjør det teknisk vanskelig å undersøke og kvantifisere histopatologiske endringer. For å imøtekomme dette behovet utviklet vi et lysarkmikroskop (TSLIM) som kan avbilde og digitalisere hele sneglehuset for å lette studiet av struktur-funksjonsforhold i det indre øret. Godt justerte serielle seksjoner av hele cochlea resulterer i en stabel med bilder for tredimensjonal (3D) volumgjengivelse og segmentering av individuelle strukturer for 3D-visualisering og kvantitativ analyse (dvs. lengde, bredde, overflate, volum og antall). Cochleae krever minimale behandlingstrinn (fiksering, avkalkning, dehydrering, farging og optisk clearing), som alle er kompatible med påfølgende høyoppløselig avbildning ved skanning og transmisjonselektronmikroskopi. Siden alle vevene er til stede i stablene, kan hver struktur vurderes individuelt eller i forhold til andre strukturer. I tillegg, siden bildebehandling bruker fluorescerende prober, kan immunhistokjemi og ligandbinding brukes til å identifisere spesifikke strukturer og deres 3D-volum eller distribusjon i cochlea. Her brukte vi TSLIM til å undersøke cochleae fra eldre mus for å kvantifisere tap av hårceller og spiral ganglionneuroner. I tillegg ble avanserte analyser (f.eks. klyngeanalyse) brukt til å visualisere lokale reduksjoner av spiralganglionnevroner i Rosenthals kanal langs 3D-volumet. Disse tilnærmingene demonstrerer TSLIM-mikroskopiens evne til å kvantifisere struktur-funksjonsforhold i og mellom cochleae.

Introduction

Sneglehuset er det perifere sanseorganet for hørsel hos pattedyr. Den har en kompleks spiralanatomi av repeterende sensoriske og støttende celler som er anatomisk spesialisert for å oppdage lydvibrasjoner og overføre dem til hjernen for oppfatning av hørsel. De viktigste sensoriske elementene er de indre og ytre hårcellene og deres innerverende nervefibre hvis cellelegemer utgjør spiralganglionen, som ligger innenfor Rosenthals kanal (figur 1). Disse sensoriske og nevrale strukturene er tonotopisk arrangert slik at høyfrekvente lyder transduseres i cochleabasen og lavfrekvente lyder transduseres i cochlea apex². Et anatomisk kart over denne sensoriske cellefordelingen langs spirallengden til den støttende basilære membranen kalles et cytokochleogram³ og kan sammenlignes med hørselstap som en funksjon av frekvensen som vist i et audiogram.

Den membranøse labyrinten i sneglehuset, som er omgitt av tett bein, gjør det teknisk vanskelig å undersøke mer enn én cochleastruktur om gangen. Derfor er begrunnelsen for å utvikle et lysarkmikroskop å produsere godt justerte serielle seksjoner av hele sneglehuset, slik at alle cochleastrukturer kan undersøkes i forhold til hverandre i 3D-rekonstruksjoner. Voie et ^al.4 og Voie og Spelman⁵ designet det første lysarkmikroskopet, kalt ortogonalt plan fluorescens optisk seksjoneringsmikroskop (OPFOS), for å optisk seksjonere hele cochlea. Dette mikroskopet ble imidlertid aldri kommersielt utviklet; så vårt mål var å konstruere et lysarkmikroskop kalt et tynt arklaserbildemikroskop (TSLIM; Figur 2). Design- og konstruksjonsdetaljene for TSLIM er tidligere publisert⁸. TSLIM gjorde flere forbedringer i forhold til OPFOS, inkludert bruk av et digitalkamera med lite lys kontra et CCD-kamera for bildeinnsamling, optisk kodede mikroposisjoner for nøyaktig og reproduserbar bevegelse av prøven gjennom lysarket, bruk av et kommersielt tilgjengelig, optisk klart prøvekammer og rhodaminfarging i etanol i stedet for i ryddeløsningen for å forhindre flekkutfelling i vevet. Kommersiell utvikling av lysarkmikroskoper som SPIM⁶ har fokusert på høyoppløselig avbildning av levende, små gjennomsiktige prøver, men er uegnet for hel cochlea-avbildning da de mangler tilstrekkelig arbeidsavstand. En gjennomgang av utviklingen av andre lysarkmikroskoper ble publisert av Santi⁷. TSLIMs primære fordel i forhold til andre histologiske metoder for å undersøke cochlea er å optisk seksjonere vev for 3D-rekonstruksjon samtidig som prøvens integritet bevares slik at den kan brukes av andre histologiske metoder. En annen fordel med TSLIM-avbildning er at bare et tynt lysark produsert av en laser blir utsatt for vevet, sammenlignet med eksponering for hele vevets tykkelse for laseren som i konfokalmikroskopi. Vevsrydding for å minimere lysspredning og det faktum at bare en liten del av vevet blir utsatt for laseren, resulterer i minimal fluorokromfading (fotobleking) med lysarklaseravbildning. Imidlertid endrer prosessen med fiksering, dehydrering og rydding morfologien til cochleære strukturer og resulterer i vevskrymping sammenlignet med levende vev. Den faktiske mengden vevskrymping som oppstår ble ikke bestemt.

TSLIM ble utviklet av Shane Johnson og åtte tyske optikerstudenter (se Acknowledgements). TSLIM konstruksjonsdetaljer ble levert av Santi et ^al.8 og en skanningsversjon (sTSLIM) av Schröter et ^al.9. TSLIM fungerer som en ikke-destruktiv mikrotome til optisk seksjonsprøver og som et mikroskop for å samle 2D-serielle seksjoner gjennom hele bredden og tykkelsen av cochlea. TSLIM kan avbilde både små (mm) og store (cm), tykke prøver. Brilleglassene er luftmontert for å tillate lange arbeidsavstander med innsamlingsmål på 1x og 2x på et disseksjonsmikroskop. Disseksjonsmikroskopet har også zoomoptikk som gjør at TSLIM kan løse subcellulære og synaptiske strukturer på celler. TSLIM er utstyrt med både en blå (473 nm) og grønn (532 nm) laser for belysning som gjør det mulig å bruke en rekke fluorescerende sonder til avbildning. Målet med TSLIM er å produsere godt justerte optiske 2D-seksjoner gjennom et helt sneglehus for en komplett digital rekonstruksjon av cochleavev. Siden det er en fluorescerende metode, kan ligander og immunhistokjemi også brukes til å identifisere spesifikke cochleære strukturer.

I utgangspunktet ble en sylindrisk linse brukt til å produsere to motsatte gaussiske lysark, men det produserte absorpsjonsbildeartefakter. På grunn av arbeidet til Keller et ^al.10 ble den faste sylindriske linsen erstattet av et skanningsgalvanometerspeil for å produsere lysarket⁹. I tillegg, siden midten av lysarket er det tynneste ved strålemidjen, produseres sTSLIM 2D-bilder ved å samle en sammensetning av X-aksekolonner med data over prøvens bredde (figur 3). Denne metoden ble først beskrevet av Buytaert og Dircks¹¹. TSLIM tilpasset programvare for å kjøre og samle bilder ble utviklet ved hjelp av et grafisk program for instrumentkontroll. Lysarket beveger seg gjennom prøven og belyser et fluorescerende plan i vevet. Dette fluorescerende planet projiseres ortogonalt gjennom det gjennomsiktige prøven og samles av et disseksjonsmikroskop. Optisk kodede micropositioners tillater skanning gjennom strålemidjen i X-aksen for å samle et enkelt sammensatt 2D-bilde, og deretter flytter Z-aksen micropositioner prøven til et dypere plan i vevet for å oppnå en stabel med serielle, seksjonerte 2D-bilder (Video 1, figur 4). En stabel med translasjonsbilder samles gjennom hele bredden, tykkelsen og lengden på sneglehuset, og det er ikke nødvendig å sy sammen bilder (Video 2). Bildestakken overføres til en annen datamaskin og lastes inn i et 3D-gjengivelsesprogram for 3D-rekonstruksjon og kvantifisering. Bildestablene inneholder all digital informasjon om morfologien til et sneglehus ved mikroskopets oppløsning. Imidlertid, hvis en høyere oppløsning er nødvendig, kan den intakte cochlea behandles videre ved destruktive histologiske metoder som mikrotomsnitting, skanning og transmisjonselektronmikroskopi.

3D-gjengivelsesprogrammet brukes til å segmentere forskjellige cochleastrukturer for 3D-gjengivelse og kvantitativ analyse. For segmentering spores hver struktur i hvert 2D-bilde av stakken ved hjelp av en annen farge av et grafikkbrett og en penn (figur 5). Til nå er 20 forskjellige cochleastrukturer segmentert (figur 6). Etter segmentering kan en rekke 3D-analyser utføres. For eksempel kan 3D-gjengivelsesprogramvare praktisk talt reseksjonere cochlea i et hvilket som helst plan langs strukturens sentroid. Video 3 viser snitt tangentiell til organet til Corti, som avslører hårcellene langs lengden av basilarmembranen. Denne prosessen krever først manuell segmentering av strukturen av interesse. Deretter beregnes strukturens sentroid basert på minste kvadraters passform av splinepunkter plassert langs midten av strukturen fra basen til toppunktet, og tillater dermed en tilnærming av strukturens lengde (Video 4). En lignende prosess kalt skjelettisering kan brukes til å visualisere strukturens radiale bredde langs lengden ved hjelp av et fargekart (Video 4). Det totale volumet av hver struktur beregnes av programmet etter segmentering, men relative avstander kan også kvantifiseres og visualiseres med fargekart i en 3D-gjengivelsesprogramvare (figur 7). Segmenterte strukturer kan også eksporteres for å produsere forstørrede, helplastiske modellgjengivelser (figur 8). I tillegg kan halvautomatisk celletelling også utføres ved hjelp av 3D-gjengivelsesprogramvare (figur 9). Immunhistokjemi og ligandbinding kan brukes til å farge spesifikke cochleære strukturer, og disse strukturene kan isoleres fra andre cochleære strukturer for morfometrisk vurdering, for eksempel å produsere et cytokokleogram (figur 10). Lengde, bredde, overflate, volum og antall av alle cochleastrukturer kan bestemmes fra 3D-modellene, noe som gjør denne tilnærmingen ideell for å kartlegge cochleaskader på funksjonsnedsettelser. Spesielt kan cochleaskader på grunn av aldring, støyinduserte traumer eller andre fornærmelser vises og kvantifiseres i 3D-cochlea-rekonstruksjoner fra optiske 2D-seksjoner. Når en cochlea har blitt digitalisert, er det mange bildealgoritmer som kan brukes til å vurdere cochleaskader av vev i cochlea i det anatomiske registeret til andre cochleære vev.

Protocol

Alle prosedyrer og bruk av levende dyr har blitt gjennomgått og godkjent (protokoll-ID # 2010-38573A) av University of Minnesota Institutional Care and Use Committee (IACUC) og etterforskere som bruker disse dyrene har blitt grundig trent og testet av Research Animal Resources (RAR) veterinærer før de har tilgang til dyreavdelingene. Både hann- og hunnmus ble brukt i denne studien. 1. Cochlea fjerning for fiksering og vevsbehandling for avbildning Avlive en mus v…

Representative Results

Siden temaet for dette spesialnummeret er å avbilde effekten av aldring i sneglehuset, vil en ung (3 måneder gammel, HS2479, CBA stammemus) og eldre (23 måneder gammel, HS2521, C57 stammemus) cochleae bli brukt som eksempler. Det skal bemerkes at TSLIM er i stand til å avbilde en rekke prøver, inkludert cochleae fra mennesker, pattedyr, andre gnagere og fisk, samt andre organer som hjernen. Johnson et al. 13 publiserte en artikkel om SGNs hos unge (3 uker gamle) CB…

Discussion

Optisk snitting ved hjelp av lysplatemikroskopi for undersøkelse av cochleastrukturer er ikke mekanisk destruktiv som andre mer tradisjonelle histologiske metoder, og det gir en komplett digital oversikt over cochleastrukturer i forhold til hverandre. Tidligere metoder som overflatebehandlinger av organet til Corti¹⁴ ga et kart over hårcelletap langs lengden av basilarmembranen, men SGN-tap kunne ikke vurderes siden vevet hadde blitt dissekert bort for å avsløre Corti-organet. Alternativt gir …

Materials

Amira 3D Rendering Software	ThermoFisher Scientific		Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433
benzyl benzoate (W213810)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Bondic	Bondic		Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada
Ethanol 95% and 100%	University of Minnesota		Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)  (E5134)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
LabVIEW graphical program and Vision	National Instruments		Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504
methyl salicylate (M6742)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Olympus MVX10 dissection microscope	Olympus Corp		Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034
Rhodamine B isothiocynate, (283924)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Starna Flurometer Cell (3-G-20)	Starna Cells		Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423