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Immunology and Infection

ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト・コンプレックスと再発熱ボレリアからのスピロヘータの栽培方法

Published: November 25, 2022
doi:
10.3791/64431
, , , , , ,
1Department of Biology,Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology,Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences,Institute of Parasitology

Summary

体外培養は、生菌の存在を直接検出する方法です。このプロトコルは、ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト複合体、再発熱ボレリア種、およびボレリア・ミヤモトイのものを含む、多様なボレリア・スピロヘータの培養方法について説明しています。これらの種は潔癖で成長が遅いですが、培養することができます。

Abstract

ボレリアは、ライムボレリア症(LB)グループの3つの種グループで構成され、B.ブルグドルフェリセンスラト(s.l.)としても知られ、最近ボレリエラ、再発熱(RF)グループボレリア、およびスピロヘータの3番目の爬虫類関連グループに再分類されました。体液または組織からの病原体の培養が複製病原体を直接検出し、研究のためのソース材料を提供するため、培養ベースの方法は、研究と臨床作業の両方で細菌感染の実験室検出のゴールドスタンダードであり続けています。ボレリアとボレリエラ・スピロヘータは潔癖で成長が遅いため、一般的に臨床目的で培養されていません。 しかし、研究には文化が必要です。このプロトコルは、B. afzelii、B. americana、B. andersonii、B. bavariensis、B. bissettii/bissettiae、B. burgdorferi sensu stricto(s.s)、B. californiensis、B. carolinensis、B. chilensis、B. finlandensis、B. garinii、B. japonica、B. kurtenbachii、B. lanei、 B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis, and RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis, B. miyamotoi.LBおよびRFスピロヘータを成長させるための基本的な培地は、確立された培養物におけるスピロヘータの成長を確実にサポートするバーバー・ストーナー・ケリー(BSK-IIまたはBSK-H)培地です。接種材料中で初期スピロヘータ数が低いダニまたは宿主由来のサンプルから新たに単離されたボレリア分離株を増殖させることができるように、修飾ケリー・ペッテンコーファー(MKP)培地が好ましい。この培地は、B. miyamotoiの増殖もサポートします。RFスピロヘータの栽培の成功は、成分の品質にも大きく依存します。

Introduction

ボレリアは、ライムボレリア症(LB)グループ、再発熱(RF)グループ、および爬虫類に限定されているように見えるあまり特徴のないグループの3つの主要なクレードを含むスピロヘータ細菌の属です。ボレリア分類学は、他のほとんどの分類群1,2,3,4,5,6,7と同様に、ゲノムとプロテオームの比較を可能にする分子方法論の出現により流動的である。LBグループ(ライム病グループとも呼ばれます)は、伝統的に、その最も特徴的なメンバーであるボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクトにちなんでボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラトと呼ばれています。この論文では、現在最も広く使用されている用語であるLB、RF、および爬虫類関連グループを使用し、LBおよびRFグループの培養プロトコルについて説明します。

スピロヘタ科のメンバーに期待されるように、ボレリアは、典型的には長さ20〜30μm、幅0.2〜0.3μmの独特の長くて細いらせん形状を採用することができる。しかし、ボレリア細胞は非常に多形性であり、それらの複雑な細胞および遺伝子構造の結果として、培養およびin vivoの両方で他の多くの形状を採用することができます1,8。そのスピロヘータ形態では、平面正弦波形態は、内膜と外膜の間のペリプラズム空間で回転する軸方向の鞭毛藻に起因します。この構造は、細胞が宿主組織と相互作用することを可能にするタンパク質を含む外膜を有する、細胞を高度に運動させることを可能にする9,10。外膜タンパク質の発現は厳密に調節されており、宿主組織への浸潤だけでなく、宿主免疫系との相互作用にも影響を及ぼす11。この複雑な遺伝子発現により、ボレリア細胞は脊椎動物宿主と無脊椎動物ベクターの非常に異なる環境の間を行き来することができます。ボレリアのゲノムは原核生物の間では珍しく、環状染色体ではなく線状染色体で構成されています。直鎖染色体に加えて、ボレリア種は7〜21個のプラスミドを含み、いくつかは線状およびいくつかは環状である。プラスミドは宿主の適応と病原性に必要な遺伝子の大部分を保持しており、プロファージに由来する環状プラスミドは、スピロヘータ細胞間の水平遺伝子流動の大部分を担っていると考えられています12,13。宿主適応における役割と一致して、ライムボレリア症群の一部、おそらく多くまたはすべてのメンバーは、培養においてプラスミドを失う14。B. burgdorferiの最も研究されている「実験室適応」株であるB31は、この種の野生分離株に見られる9つのプラスミドのうち7つだけを持っています15。同様に、B. gariniiは培養16でプラスミドを失います。いくつかの研究では、RF種とB. miyamotoiが培養時にプラスミドを保持することが示されています14,17が、最近の研究では、長期間のin vitro培養でプラスミドと感染力が変化していることが示されています18。

培養ベースの方法は、研究と臨床研究の両方において、細菌感染症の実験室検出のゴールドスタンダードであり続けています14,17。体液または組織からの病原体の培養は、複製病原体を直接検出し、研究のためのソース材料を提供します14,17。このプロトコルは、LBグループ、RFボレリアおよびB.miyamotoiのスピロヘータをうまく培養するために必要な方法論とレシピを示しています。ボレリア・スピロヘータを増殖させるための基本的な培地は、汚染された原核生物の増殖を減少させるための抗生物質の有無にかかわらず、バーバー・ストーナー・ケリー培地(BSK-IIまたは市販のBSK-H)である。この培地は、もともとRFボレリア19をサポートするために使用されていた培地から適応され、Stoenner20によってさらに変更され、次にBarbour21によって修正されました。それ以来、多くの改変が開発されており、それぞれが細菌生理機能に影響を及ぼし、成長、感染力、および病原性に影響を与える可能性があります22。この培地は、確立された培養物におけるスピロヘータの成長を確実に支持し、ダニ、哺乳類、および臨床サンプルからスピロヘータを単離するために使用されています23。より最近開発されたバリエーションである修飾ケリー・ペッテンコーファー(MKP)培地は、培養物の播種に利用可能なサンプル中に存在するスピロヘータの数が少ない場合に、環境サンプルから新しいボレリア分離株を単離する際に、より良い単離成功、形態、および運動性を提供できます23,24。すべての場合において、栽培の成功は、新たに調製された培地と適切な成分の使用に大きく依存しています。すべての市販の原料が高品質の培地を生産するわけではありません。接種培養物は、少量の残留周囲酸素の存在下で、従来の32〜34°Cのインキュベーター内で振とうすることなく便利にインキュベートすることができる。ボレリア・スピロヘータは嫌気性菌ですが、自然界では酸素と二酸化炭素の濃度の変動にさらされ、遺伝子発現の変化に応答します26,27,28,29。したがって、遺伝子発現、成長、およびその他の代謝研究は、酸素制御インキュベーターまたは嫌気性チャンバーを使用して酸素および二酸化炭素レベルを制御する必要があります。培養では、培養物は毎週、またはより頻繁に、暗視野顕微鏡または位相差顕微鏡のいずれかでスピロヘータの存在についてチェックされます。培養塗抹標本は、銀染色、免疫組織化学、または蛍光タグ付き株29、30のいずれかで染色することができる。PCRとそれに続くDNAシーケンシングは、ボレリア種を検出し、遺伝的に同定または確認するための高感度で特異的な方法です30、31、32、33。

BSK-IIには多くのマイナーなバリエーションが存在し、一部は市販されています。セクション1でここで説明されているプロトコルは、Barbour (1984)21から適応されています。液体MKP培地は、より最近開発された培地であり、セクション2に記載されている。これは、以前に報告されたプロトコル33,34に従って調製され、BSK培地と同様に、基本培地の調製および完全培地の調製の2つの工程からなる。ボレリア培養培地は、セクション3に記載されているように、抗生物質の有無にかかわらず調製できます。抗生物質は、セクション4で説明されているように、臨床サンプルまたは環境サンプルを接種するときに導入される汚染細菌を減らすように機能します。純粋なボレリアsp.培養物を接種する場合、抗生物質は必要ないかもしれません。ボレリアの長期株を作ることはしばしば重要であり、そのためのプロトコルはセクション5で説明されています。セクション6では、これらの培地を使用して、臨床サンプルまたは環境サンプルから純粋なボレリアセンスラトクローンを単離する方法について説明します。可能なアプローチはいくつかあります36。以下は効果的であることが判明したものです。このプロトコルで使用されるプレーティング媒体は、BSK-IIメッキ培地37およびMKP培地34の改変です(ウサギ血清を10%38に増加)。

Protocol

ヒト被験者から得られたサンプルを含むすべての研究は、関連する大学および/または医療施設の治験審査委員会によって承認され、サンプルが収集される前に参加者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。動物から得られたサンプルを含むすべての研究は、施設動物倫理委員会のガイドラインの下で承認され、実施されました。必要に応じて、環境サンプリングの承認が…

Representative Results

ボレリア 培地BSKおよびMKP、およびバリアントは、順次調製および滅菌する必要がある成分を含む豊富な培地です。正しく調製されると、BSK培地は赤橙色で透明になります(図1)。加温後も持続する濁度と沈殿は、問題のある成分、中程度の生産、または汚染を示しています。そのような培地は捨てるのが一番です。ゼラチンをBSKおよびMKPに添加すると、冷蔵すると…

Discussion

細菌の実験室培養は研究の出発点です。培養能力によってもたらされる大きな利点は、梅毒の病因であるスピロヘータであるトレポネーマパリダムを培養するために、ごく最近成功に至った1世紀以上にわたる闘争によって例示されます44。ボレリア・スピロヘータも培養に挑戦的であるが、培養は可能である23、24、<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、カナダ自然科学工学研究評議会とカナダライム病財団(ABおよびVL)、スウェーデン研究評議会(SB、M-LF、IN)、TAČR GAMA 2プロジェクト-「生物学センターCASでのアプリケーションポテンシャル検証2.0のサポート」(TP01010022)(MGおよびNR)、およびチェコ共和国保健省NV19-05-00191(MGおよびNR)からの助成金によって部分的にサポートされました。図4の画像についてはS. Vranjes(2021、Rudenkoラボ)に、図5の画像についてはJ. Thomas-Ebbett(2021、ロイドラボ)に感謝します。この分野に貢献したすべての研究者に感謝し、スペースの制限のために引用できなかった研究者に謝罪します。

Materials

1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item – any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item – any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item – any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item – any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item – any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item – any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item – any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item – any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item – any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item – any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item – any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item – any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important – see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item – any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item – any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item – any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item – any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item – any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item – any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item – any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item – any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top – ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item – any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item – any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item – any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item – any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item – any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item – any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item – any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item – any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item – any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item – any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item – any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item – any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item – any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item – any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item – any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item – any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item – any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item – any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item – any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item – any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item – any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item – any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item – any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item – any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item – any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item – any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item – any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item – any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item – any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item – any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item – any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item – any supplier will do
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References

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Berthold, A., Faucillion, M., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).
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