Borrelia burgdorferi Sensu Lato Kompleksi ve Tekrarlayan Ateş Borrelia'dan Spiroketlerin Yetiştirme Yöntemleri

Summary

İn vitro kültür, canlı bakterilerin varlığı için doğrudan bir tespit yöntemidir. Bu protokol, Borrelia burgdorferi sensu lato kompleksi, tekrarlayan ateş Borrelia türleri ve Borrelia miyamotoi dahil olmak üzere çeşitli Borrelia spiroketlerinin kültürü için yöntemleri açıklamaktadır. Bu türler titiz ve yavaş büyür, ancak kültürlenebilir.

Abstract

Borrelia, B. burgdorferi sensu lato (s.l.) olarak da bilinen ve yakın zamanda Borreliella, tekrarlayan ateş (RF) grubu Borrelia ve üçüncü bir sürüngen ilişkili spiroket grubu olarak yeniden sınıflandırılan Lyme borreliosis (LB) grubundan oluşan üç tür grubundan oluşur. Kültüre dayalı yöntemler, hem araştırma hem de klinik çalışmalar için bakteriyel enfeksiyonların laboratuvar tespiti için altın standart olmaya devam etmektedir, çünkü vücut sıvılarından veya dokularından patojenlerin kültürü, çoğalan patojenleri doğrudan tespit eder ve araştırma için kaynak materyal sağlar. Borrelia ve Borreliella spiroketleri titiz ve yavaş büyür ve bu nedenle klinik amaçlar için yaygın olarak kültürlenmezler; Ancak, araştırma için kültür gereklidir. Bu protokol, B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis ve RFspiroketleri, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis ve B. miyamotoi. LB ve RF spiroketlerinin yetiştirilmesi için temel ortam, yerleşik kültürlerde spiroketlerin büyümesini güvenilir bir şekilde destekleyen Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II veya BSK-H) ortamıdır. İnokulumda başlangıç spiroket sayısının düşük olduğu kene veya konakçı kaynaklı örneklerden yeni izole edilmiş Borrelia izolatlarını yetiştirebilmek için, modifiye Kelly-Pettenkofer (MKP) ortamı tercih edilir. Bu ortam aynı zamanda B. miyamotoi’nin büyümesini de destekler.RF spiroketlerin yetiştiriciliğinin başarısı da kritik olarak bileşenlerin kalitesine bağlıdır.

Introduction

Borrelia, üç ana kladeyi kapsayan bir spiroket bakteri cinsidir: Lyme borreliosis (LB) grubu, tekrarlayan ateş (RF) grubu ve görünüşte sürüngenlerle sınırlı olan daha az iyi karakterize edilmiş bir grup. Borrelia taksonomisi, diğer birçok taksonomik grup 1,2,3,4,5,6,7 için geçerli olduğu gibi^, genom ve proteom karşılaştırmalarına izin veren moleküler metodolojilerin ortaya çıkmasıyla uyum içindedir. LB grubu (Lyme hastalığı grubu olarak da adlandırılır) geleneksel olarak en iyi karakterize edilen üyesi Borrelia burgdorferi sensu stricto’dan sonra Borrelia burgdorferi sensu lato olarak adlandırılmıştır.  Bu makale şu anda en yaygın kullanılan terminolojiyi kullanmaktadır: LB, RF ve sürüngenle ilişkili grup, LB ve RF grupları için kültür protokollerini açıklamaktadır.

Spirochaetaceae familyasının bir üyesi için beklendiği gibi, Borrelia, tipik olarak 20-30 μm uzunluğunda ve 0.2-0.3 μm genişliğinde, belirgin şekilde uzun ve ince spiral şeklini benimseyebilir. Bununla birlikte, Borrelia hücreleri oldukça pleomorfiktir ve karmaşık hücresel ve genetik yapılarının bir sonucu olarak hem kültürde hem de in vivo ^1,8’de birçok başka şekli benimseyebilir. Spiroketal formunda, düzlemsel sinüs dalgası morfolojisi, iç ve dış zarlar arasındaki periplazmik boşlukta dönen eksenel endoflagellasından kaynaklanır. Bu yapı, hücrelerin konakçı dokularla etkileşime girmesini sağlayan proteinler içeren dış zar ile hücrelerin oldukça hareketli olmasını sağlar ^9,10. Dış zar proteinlerinin ekspresyonu sıkı bir şekilde düzenlenir ve sadece konakçı doku invazyonunu değil, aynı zamanda konakçı bağışıklık sistemi ile etkileşimi de etkiler¹¹. Bu karmaşık gen ekspresyonu, Borrelia hücrelerinin omurgalı konakçıların ve omurgasız vektörlerin çok farklı ortamları arasında mekik dokumasına izin verir. Borrelia’nın genomu, dairesel bir kromozomdan ziyade doğrusal bir kromozomdan oluşan prokaryotlar arasında olağandışıdır. Doğrusal kromozoma ek olarak, Borrelia türleri bazıları doğrusal ve bazıları dairesel olmak üzere 7-21 plazmid içerir. Plazmidler, konakçı adaptasyonu ve virülans için gerekli genlerin çoğunu barındırır ve profajlardan türetilen dairesel plazmidlerin, spiroketal hücreler arasındaki yatay gen akışının çoğunluğundan sorumlu olduğu düşünülmektedir^12,13. Konakçı adaptasyonundaki rolüyle tutarlı olarak, Lyme borreliosis grubunun bazıları, muhtemelen çoğu veya tümü, kültür^14’te plazmidleri kaybeder. B. burgdorferi’nin en iyi çalışılmış “laboratuvara uyarlanmış” suşu olan B31, bu türün vahşi izolatlarında bulunan dokuz plazmidden sadece yedisine sahiptir¹⁵. Benzer şekilde, B. garinii kültür^16’da plazmidleri kaybeder. Bazı çalışmalar, RF türlerinin ve B. miyamotoi’nin kültürlendiğinde plazmidleri koruduğunu göstermiştir^14,17, ancak son çalışmalar uzun süreli in vitro ekim ile değişmiş plazmidleri ve bulaşıcılık göstermektedir ¹⁸.

Kültüre dayalı yöntemler, hem araştırma hem de klinik çalışmalar için bakteriyel enfeksiyonların laboratuvar tespitinde altın standart olmaya devam etmektedir^14,17. Vücut sıvılarından veya dokularından patojenlerin kültürü, çoğalan patojenleri doğrudan tespit eder ve araştırma için kaynak materyal sağlar^14,17. Bu protokol, LB grubunun spiroketlerinin yanı sıra RF Borrelia ve B. miyamotoi’nin spiroşetlerini başarılı bir şekilde kültürlemek için gereken metodolojiyi ve tarifleri göstermektedir. Borrelia spiroketlerinin yetiştirilmesi için temel ortam, kirletici prokaryotların büyümesini azaltmak için antibiyotikli veya antibiyotiksiz Barbour-Stoenner-Kelly ortamıdır (BSK-II veya ticari olarak temin edilebilen BSK-H). Bu ortam, başlangıçta RF Borrelia^19’u desteklemek için kullanılan bir ortamdan uyarlandı, Stoenner²⁰ ve daha sonra Barbour²¹ tarafından daha da değiştirildi. O zamandan beri, her biri büyümeyi, bulaşıcılığı ve patojeniteyi etkileyebilecek bakteriyel fizyoloji üzerinde etkileri olan birçok modifikasyon geliştirilmiştir²². Bu ortam, yerleşik kültürlerde spiroketlerin büyümesini güvenilir bir şekilde destekler ve spiroketleri kene, memeli ve klinik örneklerden izole etmek için kullanılmıştır²³. Daha yakın zamanda geliştirilen varyasyon, modifiye Kelly-Pettenkofer (MKP) ortamı, yeni Borrelia izolatlarını çevresel örneklerden izole ederken, kültürü tohumlamak için mevcut numunede bulunan spiroket sayısı düşük olduğunda daha iyi izolasyon başarısı, morfoloji ve motilite, ^23,24 sağlayabilir. Her durumda, yetiştiriciliğin başarısı kritik olarak taze hazırlanmış ortama ve uygun bileşenlerin kullanımına bağlıdır; Tüm ticari bileşenler yüksek kaliteli ortam üretmez. Aşılanmış kültürler, az miktarda artık ortam oksijeni varlığında geleneksel bir 32-34 ° C inkübatörde sallanmadan rahatça inkübe edilebilir. Borrelia spiroketleri anaeroblardır, ancak doğada oksijen ve karbondioksit konsantrasyonlarındaki dalgalanmalara maruz kalırlar ve gen ekspresyonundaki değişikliklerle yanıt verirler^26,27,28,29. Bu nedenle, gen ekspresyonu, büyüme ve diğer metabolik çalışmalar, oksijen kontrollü bir inkübatör veya anaerobik oda kullanılarak oksijen ve karbondioksit seviyelerini kontrol etmelidir. Kültürde, kültürler haftalık olarak veya daha sık, karanlık alan mikroskobu veya faz kontrast mikroskobu ile spiroketlerin varlığı açısından kontrol edilir. Kültür yaymaları gümüş lekeleri, immünohistokimya veya floresan etiketli suşların kullanımı ile^{boyanabilir 29,30}. PCR’yi takiben DNA dizilimi, Borrelia türlerini^30,31,32,33 tespit etmek ve genetik olarak tanımlamak veya doğrulamak için hassas ve spesifik bir yöntemdir.

BSK-II üzerinde birçok küçük varyasyon mevcuttur ve bazıları ticari olarak temin edilebilir. Burada bölüm 1’de açıklanan protokol Barbour (1984)^21’den uyarlanmıştır. Sıvı MKP ortamı daha yeni geliştirilmiş bir ortamdır ve bölüm 2’de açıklanmıştır. BSK ortamına benzer şekilde iki adımdan oluşan daha önce bildirilen bir protokol^33,34’e göre hazırlanır: temel ortamın hazırlanması ve tam ortamın hazırlanması. Borrelia kültür ortamı, bölüm 3’te açıklandığı gibi antibiyotikli veya antibiyotiksiz olarak hazırlanabilir; Antibiyotikler, bölüm 4’te açıklandığı gibi, klinik veya çevresel örneklerle aşılama sırasında ortaya çıkan kirletici bakterileri azaltmak için hareket eder; saf Borrelia sp. kültürü ile aşılanırsa, antibiyotiklere ihtiyaç duyulmayabilir. Uzun vadeli Borrelia stokları yapmak genellikle önemlidir ve bunu yapmak için bir protokol bölüm 5’te açıklanmıştır. Bölüm 6, saf Borrelia sensu lato klonlarını klinik veya çevresel örneklerden izole etmek için bu ortamların kullanılmasını açıklamaktadır. Olası bir dizi yaklaşım vardır³⁶; Aşağıda etkili olduğu tespit edilen bir tanesi verilmiştir. Bu protokolde kullanılan kaplama ortamı, BSK-II kaplama ortamı 37 ve MKP ortamı^34’ün bir modifikasyonudur (tavşan serumu% 10’a yükseltilmiş) ³⁸).

Protocol

İnsan deneklerden elde edilen örnekleri içeren tüm çalışmalar, ilgili Üniversite ve/veya tıbbi tesisin Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmış ve örnekler toplanmadan önce katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Hayvanlardan alınan örnekleri içeren tüm çalışmalar Kurumsal Hayvan Etik Kurulu rehberliğinde onaylanmış ve yürütülmüştür. İlgili olduğunda, çevresel örnekleme için onaylar alınmıştır. NOT: Kültürün başarıs?…

Representative Results

Borrelia kültür ortamı BSK ve MKP ve varyantları, sırayla hazırlanması ve sterilize edilmesi gereken bileşenlere sahip zengin kültür ortamlarıdır. Doğru hazırlandığında, BSK ortamı kırmızı-turuncu ve berrak olmalıdır (Şekil 1). Isınmadan sonra devam eden bulanıklık ve yağış, sorunlu içerikleri, orta üretimi veya kontaminasyonu gösterir; Böyle bir ortam en iyi şekilde atılır. BSK’ya ve MKP’ye jelatin eklenirse, ortam soğutulduğunda jelatinli ola…

Discussion

Bakterilerin laboratuvar kültürü, araştırma için sıçrama tahtasıdır. Kültür yeteneğinin sağladığı derin avantaj, bir yüzyıldan fazla bir süredir ancak son zamanlarda başarı ile sonuçlanan, sifilizin etiyolojik ajanı olan Treponema pallidum’un kültürüne verilen mücadeleyle örneklenmektedir⁴⁴. Borrelia spiroketleri de kültüre meydan okuyor, ancak kültür mümkün 23,24,34,44,45,46,47,48,49.<s…

Materials

1.7 mL tubes	VWR	87003-294	Standard item – any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter	VWR	28145-501	Standard item – any supplier will do
10 µL barrier pipette tip	Neptune	BT10XLS3	Standard item – any supplier will do
10 mL Serological pipettes	Celltreat	229011B	Standard item – any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip	Neptune	BT1000.96	Standard item – any supplier will do
15 mL tube	Celltreat	188261	Standard item – any supplier will do
20 µL barrier pipette tip	Neptune	BT20	Standard item – any supplier will do
20 mL Sterile syringe	BD	309661	Standard item – any supplier will do
200 µL barrier pipette tip	Neptune	BT200	Standard item – any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes	Fisher Scientific	14-933C	Standard item – any supplier will do
25 mL Serological pipettes	Celltreat	229025B	Standard item – any supplier will do
3 mL Sterile syringe	BD	309657	Standard item – any supplier will do
35% BSA	Sigma	A-7409	Source is important – see note
5 mL Serological pipettes	Celltreat	229006B	Standard item – any supplier will do
50 mL tube	Celltreat	229421	Standard item – any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes	Schott	Schott Nr. 26 135 115	Standard item – any supplier will do
Amikacine	Sigma	PHR1654	Standard item – any supplier will do
Amphotericin B	Sigma	A9528-100MG	Standard item – any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole	Sigma	PHR1126-1G	Standard item – any supplier will do
BBL Brucella broth	BD	211088	Standard item – any supplier will do
Biosafety Cabinet	Labconco	302419100	Standard item – any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top – ACD)	Fisher Scientific	BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD)	Standard item – any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]	Darlynn biologicals	BB83-500	Standard item – any supplier will do
centrifuge	Eppendorf	model 5430	Standard item – any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate	Sigma	C-8532 100 g	Standard item – any supplier will do
CMRL	Gibco BRL	21540 500 mL	Standard item – any supplier will do
CMRL-1066	Gibco	21-510-018	Standard item – any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene)	Fisher Scientific	5000-0020	Standard item – any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm	Sigma	P7741	Standard item – any supplier will do
Digital Incubator	VWR	model 1545	Standard item – any supplier will do
DMSO	ThermoFisher	D12345	Standard item – any supplier will do
Filters for filter sterilization	Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane	SCGPU05RE	Standard item – any supplier will do
Gelatin	Difco BD	214340 500 g	Standard item – any supplier will do
Glass Culture Tubes	Fisher Scientific	99449-20	Standard item – any supplier will do
Glucose	Sigma	G-7021 1 kg	Standard item – any supplier will do
Glycerol	Sigma	G5516	Standard item – any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge )	Labwissen	Model 3220	Standard item – any supplier will do
HEPES	Sigma	H-3784 100 g	Standard item – any supplier will do
N-acetylglucoseamine	Sigma	A-3286 25 g	Standard item – any supplier will do
Neopeptone	Difco  BD	211681 500 g	Standard item – any supplier will do
Neubauer Hematocytometer	Sigma	Z359629	Standard item – any supplier will do
Phase contrast microscope	Leitz		Standard item – any supplier will do
Phosphomycin	Sigma	P5396-1G	Standard item – any supplier will do
Phosphomycine	Sigma	P5396	Standard item – any supplier will do
Pipetboy	Integra		Standard item – any supplier will do
Precision Standard Balance	OHAUS	model TS200S	Standard item – any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt)	Sigma	P-8574 25 g	Standard item – any supplier will do
Rabbit Serum	Gibco	16-120-032	Source is important
Rabbit Serum	Sigma	R-4505  100 mL	Source is important
Rifampicin	Sigma	R3501-1G	Standard item – any supplier will do
Sodium bicarbonate	Sigma	S-5761     500 g	Standard item – any supplier will do
Sufametaxazole	Sigma	PHR1126	Standard item – any supplier will do
TC Yeastolate	Difco  BD	255752 100 g	Standard item – any supplier will do
Transfer Pipettes	VWR	470225-044	Standard item – any supplier will do
Trimethoprim	Sigma	PHR1056	Standard item – any supplier will do