绝育对于气管组织移植至关重要。在这里,我们提出了一种使用器官完全耐受的低剂量伽马辐照的灭菌方案。
确保移植正确发展的主要关键方面之一是培养基的无菌性。脱细胞气管移植涉及植入最初与环境接触的器官,因此从一开始就不是无菌的。虽然脱细胞方案(通过洗涤剂暴露[2%十二烷基硫酸钠],连续搅拌和渗透冲击)是按照无菌措施进行的,但它不提供灭菌。因此,主要挑战之一是在 体内 植入之前确保无菌。虽然对无机材料有既定的伽马辐射灭菌规程,但对有机材料没有这样的措施。此外,无机材料的协议不能应用于有机材料,因为既定的辐射剂量(25 kGy)会完全破坏植入物。本文研究了辐射剂量递增对去细胞化兔气管的影响。我们维持剂量范围(kGy)并测试递增剂量,直到找到达到灭菌的最小剂量。确定剂量后,我们研究了它对器官的组织学和生物力学的影响。我们确定,虽然0.5 kGy没有达到无菌,但1 kGy和2 kGy的剂量都可以,因此1 kGy是实现灭菌所需的最小剂量。显微镜研究显示,与未消毒的器官相比,没有相关变化。轴向生物力学特性根本没有改变,并且仅观察到器官可以径向耐受的每单位长度的力略有减少。因此,我们可以得出结论,1 kGy实现了脱细胞兔气管的完全灭菌,对器官的影响很小(如果有的话)。
植入物的灭菌是其生存能力的基本要求;事实上,已被证明成功的假肢是植入无菌区域(血管、心脏、骨骼等)的假肢。1.气管有两个表面:一个与外部环境接触的表面,因此不是无菌的,另一个是朝向纵隔的表面,它是无菌的。因此,从提取气管的那一刻起,它就不是无菌器官。尽管随后的脱细胞过程是在最大无菌条件下进行的,但它不是灭菌步骤2。异物的植入本身就存在感染的风险,因为它产生的前细菌微环境3,即使材料已经过灭菌,疾病从供体传播到受体的风险高达0.014%4。为了确保气管的正确血管化,在几乎所有实验移植方案中,它首先将异位植入物5,6,7到无菌区域(肌肉,筋膜,网膜,皮下等);这是因为在该培养基中植入非无菌元件会导致区域3 的感染。
有一系列可能的策略可以获得无菌植入物。使用超临界CO2实现了终端灭菌8,9。其他方法,例如紫外线辐射或用过氧乙酸,乙醇,过氧化氧和电解水等物质进行处理,在灭菌中获得了不同的成功率,几乎总是取决于它们的剂量,但它们已被证明会影响植入物的生物力学特性。事实上,一些物质,如环氧乙烷,可以显著改变植入基质的结构,甚至会引起不良的免疫原性效应。因此,许多这些策略不能应用于生物模型2,10,11,12,13。
最广泛研究和接受的灭菌策略是由ISO 11737-1:2006标准建立的,用于对植入人体的医疗器械进行灭菌,伽马辐射剂量为25 kGy。但是,该法规仅侧重于惰性,非生物元素的灭菌14,15。此外,在癌的根治治疗中,放射治疗剂量比用于对医疗器械进行灭菌的剂量低三个数量级1。考虑到这一点,我们可以得出结论,所述剂量不仅会杀死微生物群,还会破坏并从根本上改变植入物的生物结构。它还有可能在降解时产生残留脂质,这可能具有细胞毒性并加速支架13,14,15,16,17的酶降解,即使使用低至1.9 kGy的剂量并且损害与接受的辐射剂量成正比17。
因此,本文的目的是尝试确定允许获得无菌植入物的辐射剂量,而辐射引起的有害影响最小2,18,19。我们遵循的策略涉及在千格雷范围内(0.5、1、2、3 kGy等)以不同的递增剂量照射脱细胞和辐照气管,直到培养结果为阴性。对培养结果为阴性的剂量进行了额外的测试,以确认灭菌。在确定获得灭菌的最小剂量后,检查照射对气管的结构和生物力学影响。将所有指标与对照组本地兔气管进行比较。然后将气管植入新西兰白兔体内,在体内测试结构的灭菌。
有几种灭菌策略。超临界CO2完全穿透组织,酸化培养基并解构细胞磷脂双层,通过植入物的减压轻松消除8,14,25。紫外线辐射也被使用,其对啮齿动物气管的有效性已经发表,尽管文献中只有少数报道10。使用的其他方法包括应用过氧乙酸,乙醇,过氧化氧或电解水等物质,这些物质已产生不规则的结?…
The authors have nothing to disclose.
本文得到了2018年西班牙胸外科学会对国家多中心研究的资助[授予Néstor J.Martínez-Hernández的180101号]和PI16-01315(授予Manuel Mata-Roig)的支持。CIBERER由VI National R&D&I Plan 2018-2011,Iniciativa Ingenio 2010,Consolider Program,CIBER Actions和Instituto de Salud Carlos III资助,并得到欧洲区域发展基金的援助。
6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) | DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA | D9542 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Fischer Scientific, Madrid, Spain | 12678646 | |
Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |