Esterilización por radiación gamma de baja dosis para injertos traqueales descelularizados
Summary
La esterilización es esencial para el trasplante de tejido traqueal. En este documento, presentamos un protocolo de esterilización utilizando irradiación gamma de baja dosis que es totalmente tolerada por los órganos.
Abstract
Uno de los principales aspectos clave para asegurar que un trasplante evoluciona correctamente es la esterilidad del medio. El trasplante traqueal descelularizado implica implantar un órgano que originalmente estaba en contacto con el medio ambiente, por lo que no es estéril desde el principio. Si bien el protocolo de descelularización (a través de la exposición con detergente [dodecil sulfato de sodio al 2%, agitación continua y choques osmóticos) se lleva a cabo de acuerdo con las medidas asépticas, no proporciona esterilización. Por lo tanto, uno de los principales desafíos es garantizar la esterilidad previa a la implantación in vivo . Aunque existen protocolos establecidos de esterilización por radiación gamma para materiales inorgánicos, no existen tales medidas para materiales orgánicos. Además, los protocolos establecidos para materiales inorgánicos no se pueden aplicar a materiales orgánicos, ya que la dosis de radiación establecida (25 kGy) destruiría completamente el implante. Este artículo estudia el efecto de una dosis de radiación escalada en una tráquea de conejo descelularizada. Mantuvimos el rango de dosis (kGy) y probamos las dosis escalonadas hasta encontrar la dosis mínima a la que se logra la esterilización. Después de determinar la dosis, estudiamos los efectos de la misma en el órgano, tanto histológica como biomecánicamente. Determinamos que mientras 0,5 kGy no alcanzaban la esterilidad, las dosis de 1 kGy y 2 kGy sí lo hacían, siendo 1 kGy, por lo tanto, la dosis mínima necesaria para lograr la esterilización. Los estudios microscópicos no mostraron cambios relevantes en comparación con los órganos no esterilizados. Las características biomecánicas axiales no se alteraron en absoluto, y solo se observó una ligera reducción en la fuerza por unidad de longitud que el órgano puede tolerar radialmente. Por lo tanto, podemos concluir que 1 kGy logra la esterilización completa de la tráquea de conejo descelularizada con un efecto mínimo, si es que tiene alguno, en el órgano.
Introduction
La esterilización de un implante es un requisito básico para su viabilidad; De hecho, las prótesis que han demostrado ser exitosas son aquellas implantadas en áreas estériles (vasos sanguíneos, corazón, hueso, etc.) 1. La tráquea tiene dos superficies: una superficie en contacto con el ambiente externo, que por lo tanto no es estéril, y una superficie hacia el mediastino, que es estéril. Por lo tanto, desde el momento en que se extrae la tráquea, no es un órgano estéril. A pesar de que el proceso de descelularización posterior se lleva a cabo en condiciones máximas estériles, no es una etapa de esterilización2. La implantación de material extraño en sí misma conlleva un riesgo de infección debido al microambiente probacteriano que produce3y un riesgo de transmisión de enfermedades del donante al receptor, incluso si el material ha sido esterilizado4. Para asegurar la correcta vascularización de la tráquea, en casi todos los protocolos experimentales de trasplante, primero se somete al implante heterotópico 5,6,7 en un área estéril (músculo, fascia, epiplón, subcutáneo, etc.); Esto se debe a que la implantación de un elemento no estéril en este medio conduciría a la infección del área3.
Hay una gama de estrategias posibles para obtener un implante estéril. El uso deCO2supercrítico ha logrado la esterilización terminal 8,9. Otros métodos, como la radiación ultravioleta o el tratamiento con sustancias como el ácido peracético, el etanol, el peróxido de oxígeno y el agua electrolizada, han obtenido diferentes tasas de éxito en la esterilización, casi siempre dependiendo de sus dosis, pero se ha demostrado que afectan a las características biomecánicas de los implantes. De hecho, algunas sustancias, como el óxido de etileno, pueden cambiar sustancialmente la estructura de la matriz implantada e incluso pueden causar efectos inmunogénicos indeseables. Por esta razón, muchas de estas estrategias no pueden ser aplicadas a modelos biológicos 2,10,11,12,13.
La estrategia de esterilización más estudiada y aceptada es la establecida por la norma ISO 11737-1:2006 para la esterilización de productos sanitarios implantados en humanos, con una dosis de radiación gamma de 25 kGy. Sin embargo, esta regulación se centra únicamente en la esterilización de elementos inertes no biológicos14,15. Además, las dosis de radioterapia en el tratamiento radical del carcinoma son tres órdenes de magnitud inferiores a las utilizadas para esterilizar dispositivos médicos1. Con esto en mente, podemos concluir que dicha dosis no solo mataría la microbiota, sino que también destruiría y alteraría radicalmente la estructura biológica del implante. También existe la posibilidad de que genere lípidos residuales tras la degradación, que potencialmente pueden ser citotóxicos y acelerar la degradación enzimática del andamio 13,14,15,16,17, incluso cuando se utilizan dosis tan bajas como 1,9 kGy y con daños directamente proporcionales a la dosis de radiación recibida 17.
Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es tratar de identificar la dosis de radiación que permite obtener un implante estéril con mínimos efectos nocivos causados por la irradiación 2,18,19. La estrategia que seguimos consistió en la irradiación de tráqueas descelularizadas e irradiadas a diferentes dosis escalonadas dentro de un rango de kilograys (0,5, 1, 2, 3 kGy, etc.), hasta lograr un cultivo negativo. Se realizaron pruebas adicionales para aquellas dosis que lograron cultivos negativos, con el fin de confirmar la esterilización. Después de determinar la dosis mínima para obtener la esterilización, se verificó el impacto estructural y biomecánico de la irradiación en la tráquea. Todas las métricas se compararon con las tráqueas de conejo nativas de control. La esterilización de la construcción se probó in vivo mediante la implantación de las tráqueas en conejos blancos de Nueva Zelanda.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existen varias estrategias de esterilización. ElCO2supercrítico penetra completamente en los tejidos, acidificando el medio y deconstruyendo la bicapa de fosfolípidos celulares con eliminación simple mediante la despresurización del implante 8,14,25. También se ha utilizado radiación ultravioleta y se ha publicado su efectividad en la tráquea de roedores, aunque hay pocos relatos en la literatura<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha sido apoyado por la Beca 2018 de la Sociedad Española de Cirugía Torácica al Estudio Nacional Multicéntrico [Número 180101 otorgado a Néstor J.Martínez-Hernández] y PI16-01315 [otorgado a Manuel Mata-Roig] por el Instituto de Salud Carlos III. El CIBERER está financiado por el VI Plan Nacional de I&D&I 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Programa Consolider, Acciones CIBER y el Instituto de Salud Carlos III, con la ayuda del Fondo Europeo de Desarrollo Regional.
Materials
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) | DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA | D9542 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Fischer Scientific, Madrid, Spain | 12678646 | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
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