Sterilisering med låg dos gammastrålning för decellulariserade trakealtransplantat
Summary
Att erhålla sterilisering är avgörande för trakeal vävnadstransplantation. Här presenterar vi ett steriliseringsprotokoll med lågdos gammabestrålning som tolereras fullt ut av organ.
Abstract
En av de viktigaste aspekterna för att säkerställa att en transplantation utvecklas korrekt är mediets sterilitet. Decellulariserad trakealtransplantation innebär att man implanterar ett organ som ursprungligen var i kontakt med miljön och därmed inte är sterilt från början. Medan decellulariseringsprotokollet (genom tvättmedelsexponering [2% natriumdodecylsulfat], kontinuerlig omrörning och osmotiska chocker) utförs i linje med aseptiska åtgärder, ger det inte sterilisering. Därför är en av de största utmaningarna att säkerställa sterilitet före implantation in vivo . Även om det finns etablerade gammastrålningssteriliseringsprotokoll för oorganiska material, finns det inga sådana åtgärder för organiska material. Dessutom kan de protokoll som finns för oorganiska material inte tillämpas på organiska material, eftersom den fastställda stråldosen (25 kGy) helt skulle förstöra implantatet. Denna uppsats studerar effekten av en eskalerad stråldos i en decellulariserad kaninluftstrupe. Vi bibehöll dosintervallet (kGy) och testade eskalerade doser tills vi hittade den minsta dos vid vilken sterilisering uppnås. Efter att ha bestämt dosen studerade vi effekterna av den på orgeln, både histologiskt och biomekaniskt. Vi bestämde att medan 0,5 kGy inte uppnådde sterilitet, gjorde doser på både 1 kGy och 2 kGy det, med 1 kGy, därför den minsta dos som krävs för att uppnå sterilisering. Mikroskopiska studier visade inga relevanta förändringar jämfört med icke-steriliserade organ. Axiala biomekaniska egenskaper förändrades inte alls, och endast en liten minskning av kraften per längdenhet som organet radiellt kan tolerera observerades. Vi kan därför dra slutsatsen att 1 kGy uppnår fullständig sterilisering av decellulariserade kaninluftstrupen med minimala, om några, effekter på organet.
Introduction
Sterilisering av ett implantat är en grundläggande förutsättning för dess livskraft; Faktum är att proteser som har visat sig vara framgångsrika är de som implanteras i sterila områden (blodkärl, hjärta, ben, etc.) 1. Luftstrupen har två ytor: en yta som är i kontakt med den yttre miljön, som därför inte är steril, och en yta mot mediastinum, som är steril. Därför är det inte ett sterilt organ från det ögonblick som luftstrupen extraheras. Trots att den efterföljande decellulariseringsprocessen utförs under maximala sterila förhållanden är det inte ett steriliseringssteg2. Implantationen av främmande material i sig medför en risk för infektion på grund av den antibakteriella mikromiljön som den producerar3och en upp till 0,014% risk för sjukdomsöverföring från givaren till mottagaren, även om materialet har steriliserats4. För att säkerställa korrekt vaskularisering av luftstrupen, i nästan alla experimentella transplantationsprotokoll, genomgår den först heterotopiskt implantat 5,6,7 till ett sterilt område (muskel, fascia, omentum, subkutant, etc.); Detta beror på att implantering av ett icke-sterilt element i detta medium skulle leda till infektion i området3.
Det finns en rad möjliga strategier för att få ett sterilt implantat. Användning av superkritisk CO2har uppnått terminal sterilisering 8,9. Andra metoder, såsom ultraviolett strålning eller behandling med ämnen som perättiksyra, etanol, syreperoxid och elektrolyserat vatten, har uppnått olika framgångsgrader vid sterilisering, nästan alltid beroende på deras doser, men de har visat sig påverka implantatens biomekaniska egenskaper. Faktum är att vissa ämnen, såsom etylenoxid, väsentligt kan förändra strukturen hos den implanterade matrisen och kan till och med orsaka oönskade immunogena effekter. Av denna anledning kan många av dessa strategier inte tillämpas på biologiska modeller 2,10,11,12,13.
Den mest studerade och accepterade steriliseringsstrategin är den som fastställts av ISO 11737-1: 2006-standarden för sterilisering av medicintekniska produkter implanterade i människor, med en gammastrålningsdos på 25 kGy. Denna förordning fokuserar emellertid endast på sterilisering av inerta, icke-biologiska element14,15. Dessutom är strålbehandlingsdoserna vid radikal behandling av karcinom tre storleksordningar lägre än de som används för att sterilisera medicintekniska produkter1. Med detta i åtanke kan vi dra slutsatsen att nämnda dos inte bara skulle döda mikrobioten utan också förstöra och radikalt förändra implantatets biologiska struktur. Det finns också en möjlighet att det skulle generera kvarvarande lipider vid nedbrytning, vilket potentiellt kan vara cytotoxiskt och påskynda den enzymatiska nedbrytningen av ställningen 13,14,15,16,17, även vid användning av doser så låga som 1,9 kGy och med skador som är direkt proportionella mot den mottagna strålningsdosen 17.
Således är syftet med detta dokument att försöka identifiera stråldosen som gör det möjligt att erhålla ett sterilt implantat med minimala skadliga effekter orsakade av bestrålning 2,18,19. Strategin vi följde involverade bestrålning av decellulariserade och bestrålade luftstrupar vid olika eskalerade doser inom ett intervall av kilograys (0,5, 1, 2, 3 kGy, etc.) tills vi uppnådde en negativ kultur. Ytterligare tester utfördes för de doser som uppnådde negativa kulturer för att bekräfta sterilisering. Efter bestämning av minimidosen för att erhålla sterilisering kontrollerades bestrålningens strukturella och biomekaniska inverkan på luftstrupen. Alla mätvärden jämfördes med kontrollens inhemska kaninluftstrupar. Steriliseringen av konstruktionen testades sedan in vivo genom att implantera luftstruparna i Nya Zeelands vita kaniner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera steriliseringsstrategier som finns. Superkritisk CO2tränger helt in i vävnader, surgör mediet och dekonstruerar det cellulära fosfolipid-dubbelskiktet med enkel eliminering genom tryckavlastning av implantatet 8,14,25. Ultraviolett strålning har också använts, och dess effektivitet i gnagare luftstrupen har publicerats, även om det bara finns ett fåtal rapporter i litteraturen<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta papper stöddes av 2018 Spanish Society of Thoracic Surgery Grant to National Multicentric Study [nummer 180101 tilldelas Néstor J.Martínez-Hernández] och PI16-01315 [tilldelas Manuel Mata-Roig] av Instituto de Salud Carlos III. CIBERER finansieras av VI National R&D &I Plan 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions och Instituto de Salud Carlos III, med stöd från Europeiska regionala utvecklingsfonden.
Materials
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) | DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA | D9542 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Fischer Scientific, Madrid, Spain | 12678646 | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
References
- Ch’ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
- Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts. Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).
- de Donato, G., et al. Prosthesis infection: prevention and treatment. The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).
- Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts. Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).
- Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research. Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).
- Hysi, I., et al. Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).
- Wurtz, A., et al. Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).
- White, A., Burns, D., Christensen, T. W. Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide. Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).
- Qiu, Q. Q., et al. Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).
- Lange, P., et al. Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).
- Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B. Ultraviolet sterilization in microbiological laboratories. Public Health Reports. 71 (4), 331-336 (1956).
- Hennessy, R. S., et al. Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves. JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Balestrini, J. L., et al. Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).
- AENOR. UNE-EN. ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos. AENOR. UNE-EN. , (2006).
- Uriarte, J. J., et al. Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).
- Sun, W. Q., Leung, P. Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation. Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).
- Nguyen, H., et al. Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts. Bone. 57 (1), 194-200 (2013).
- Helder, M. R. K., et al. Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique. Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea. Laboratorio de Anatomía Patologica. , 175-195 (1993).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts. Biomolecules. 11 (10), 1461 (2021).
- Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).
- Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
