Un modello riproducibile di impatto della cartilagine per generare l'artrosi post-traumatica nel coniglio

Summary

Il modello aperto di impatto del condilo femorale mediale nei conigli è affidabile per lo studio dell’osteoartrite post-traumatica (PTOA) e di nuove strategie terapeutiche per mitigare la progressione della PTOA. Questo protocollo genera un difetto cartilagineo isolato del condilo femorale mediale posteriore nei conigli utilizzando una torre di caduta basata su carrello con una testa del dispositivo di impatto.

Abstract

L’osteoartrite post-traumatica (PTOA) è responsabile del 12% di tutti i casi di osteoartrite negli Stati Uniti. La PTOA può essere innescata da un singolo evento traumatico, come un carico ad alto impatto che agisce sulla cartilagine articolare, o da un’instabilità articolare, come avviene con la rottura del legamento crociato anteriore. Attualmente non esistono terapie efficaci per prevenire la PTOA. Lo sviluppo di un modello animale affidabile di PTOA è necessario per comprendere meglio i meccanismi attraverso i quali procede il danno alla cartilagine e per studiare nuove strategie di trattamento per alleviare o prevenire la progressione della PTOA. Questo protocollo descrive un modello di impatto del condilo femorale di coniglio aperto e basato su una torre di caduta per indurre danni alla cartilagine. Questo modello ha fornito carichi di picco di 579,1 ± 71,1 N e sollecitazioni di picco di 81,9 ± 10,1 MPa con un carico di picco di 2,4 ± 0,5 ms. La cartilagine articolare dei condili femorali mediali (MFC) impattati aveva tassi più elevati di cellule apoptotiche (p = 0,0058) e possedeva punteggi più elevati dell’Osteoarthritis Research Society International (OARSI) di 3,38 ± 1,43 rispetto alle MFC controlaterali non impattate (0,56 ± 0,42) e ad altre superfici cartilaginee del ginocchio impattato (p < 0,0001). Non sono state rilevate differenze nei punteggi OARSI tra le superfici articolari non impattate (p > 0,05).

Introduction

L’osteoartrite post-traumatica (PTOA) è una delle principali cause di disabilità in tutto il mondo e rappresenta il 12%-16% dell’osteoartrite sintomatica (OA)¹. L’attuale gold standard per la gestione dell’OA allo stadio terminale è l’artroplastica totale del ginocchio e dell’anca² o artrodesi, come nel caso dell’artrite tibioastragalica o sottoastragalica allo stadio terminale. Sebbene abbia in gran parte successo, l’artroplastica può avere complicanze costose e morbose³. Inoltre, l’artroplastica è meno auspicabile nei pazienti di età inferiore ai 50 anni, data la bassa sopravvivenza all’impianto senza revisione, pari al 77%-83%^4,5. Attualmente, non esistono trattamenti approvati dalla FDA per prevenire o mitigare la progressione della PTOA.

La PTOA colpisce l’intera articolazione, compreso il tessuto sinoviale, l’osso subcondrale e la cartilagine articolare. È caratterizzata da degenerazione della cartilagine articolare, infiammazione sinoviale, rimodellamento dell’osso subcondrale e formazione di osteofiti ^6,7. Il fenotipo della PTOA si sviluppa attraverso un complesso processo di interazione tra cartilagine, sinovia e osso subcondrale. L’attuale comprensione è che la lesione della cartilagine porta alla liberazione di componenti della matrice extracellulare (ECM) come il collagene di tipo 2 (COL2) e l’aggrecano (ACAN). Questi frammenti di componenti dell’ECM sono pro-infiammatori e causano un aumento della produzione di IL-6, IL-1β e specie reattive dell’ossigeno. Questi mediatori agiscono sui condrociti, causando una sovraregolazione delle metalloproteinasi della matrice (MMP), come la MMP-13, che degradano la cartilagine articolare diminuendo anche la sintesi della matrice, portando a un ambiente catabolico complessivo per la cartilagine articolare⁸. Inoltre, vi è evidenza di un aumento dell’apoptosi dei condrociti nell’osteoartrite primaria e nella PTOA ^9,10. La disfunzione mitocondriale si verifica dopo un carico sovrafisiologico della cartilagine 11,12,13,14, che può portare ad un aumento dell’apoptosi dei condrociti ^12,15. L’aumento dell’apoptosi dei condrociti è stato associato a un aumento della deplezione dei proteoglicani e del catabolismo della cartilagine e ha dimostrato di precedere i cambiamenti nel rimodellamento della cartilagine e dell’osso subcondrale^16,17,18.

Come per la maggior parte delle malattie umane, sono necessari modelli affidabili e traslazionali di PTOA per comprendere ulteriormente la fisiopatologia della malattia e testare nuove terapie. Animali di grandi dimensioni come suini e canini sono stati utilizzati in modelli di frattura intra-articolare e di impatto di PTOA^17,19, ma sono costosi. I modelli animali più piccoli, come topi, ratti e conigli, sono meno costosi e vengono utilizzati per studiare la PTOA generata attraverso la destabilizzazione articolare, che in genere comporta la transezione chirurgica del legamento crociato anteriore (LCA) e/o la rottura del menisco mediale 20,21,22,23,24,25. Sebbene il trauma articolare possa portare a varie conseguenze, tra cui lesioni legamentose²⁶, il sovraccarico meccanico della cartilagine si verifica in quasi tutti i casi.

Ci sono evidenze emergenti che la patologia alla base dello sviluppo della PTOA dopo l’instabilità legamentosa (come nella transezione del LCA) e il danno condrale acuto è dovuta a meccanismi distinti²⁷. Pertanto, è importante sviluppare modelli di lesioni dirette alla cartilagine. Attualmente esiste un numero limitato di modelli di impatto che generano lesioni osteocondrali o condrali nei ratti e nei topi^28,29. Tuttavia, la cartilagine murina non è adatta a generare difetti condrali isolati. Questo perché la cartilagine articolare murina ha uno spessore di soli 3-5 strati cellulari e manca di zone cartilaginee superficiali, radiali e di transizione organizzate, nonché dello spesso strato di cartilagine calcificata che si trova negli esseri umani e negli animali più grandi. I modelli murini mostrano anche una risoluzione spontanea dei difetti parziali della cartilagine^30,31. Quindi, abbiamo scelto il coniglio per questo modello di impatto poiché il suo spessore e la sua organizzazione della cartilagine sono simili a quelli degli esseri umani, ed è il modello animale più piccolo che consentirà di fornire un impatto condrale coerente che si traduce in PTOA. Precedenti modelli chirurgici aperti dell’impatto del condilo femorale nel coniglio hanno impiegato un pendolo³², un dispositivo portatile per l’impatto della cartilagine caricato a molla 33 e una torre di caduta che ha permesso la creazione di un impattatore specifico per il coniglio³⁴. Tuttavia, questi studi mancavano di dati in vivo. Altri hanno riportato dati in vivo con dispositivi a percussione a pendolo 35, pneumatici³⁶ e caricati a molla^{37 10}, e questi studi mostrano un alto tasso di variabilità nelle sollecitazioni di picco e nei tassi di carico tra i metodi. Tuttavia, il campo manca di un approccio coerente per modellare in modo affidabile il trauma acuto della cartilagine in vivo.

L’attuale protocollo impiega un sistema basato su una torre di caduta per fornire un impatto coerente al condilo mediale posteriore del ginocchio del coniglio. Un approccio posteriore al ginocchio viene impiegato per esporre il condilo femorale mediale posteriore. Un perno di Steinman viene quindi posizionato attraverso i condili femorali da mediale a laterale in linea con la superficie articolare e fissato alla piattaforma. Una volta fissato, un carico viene consegnato al condilo femorale mediale posteriore. Questo metodo consente di infliggere danni consistenti alla cartilagine sulla superficie portante del femore distale del coniglio.

Protocol

La seguente procedura è stata eseguita con l’approvazione del Comitato per la cura e l’uso degli animali istituzionali della Indiana University School of Medicine (IACUC). Tutti gli interventi chirurgici di sopravvivenza sono stati eseguiti in condizioni sterili, come delineato dalle linee guida NIH. I rischi di dolore e infezione sono stati gestiti con analgesici e antibiotici adeguati per ottimizzare i risultati positivi. Per il presente studio sono stati utilizzati conigli bianchi neozelandesi maschi scheletricamente…

Representative Results

Il successo di questa procedura è stato monitorato immediatamente dopo l’impatto mediante la visualizzazione del condilo da parte del chirurgo (Figura 4A) e mediante radiografia per garantire che non si verificasse alcuna frattura (Figura 4B). C’è il rischio di fallimento dell’impatto che porta a una frattura intraoperatoria del condilo. Ciò era in genere dovuto a un posizionamento improprio dei perni di Steinman (Figura 5). Util…

Discussion

Questa procedura chirurgica mira a generare un danno cartilagineo consistente alla superficie portante del condilo femorale mediale del coniglio in un modello di PTOA. Un vantaggio di questa procedura è che l’approccio posteriore al ginocchio consente la visualizzazione diretta del condilo femorale mediale posteriore completo e può essere eseguito in circa 37 minuti (Tabella 2). Va anche notato che questo è un modello di lesione aperto e può portare a cambiamenti infiammatori acuti oltre il semplice …

Materials

Flat head screw	McMaster-Carr	92210A194	Stainless steel hex drive flat head screw, 8-32, 1/2"
#15 scalpel blades	McKesson	1029066	Scalpel McKesson No. 15 Stainless Steel / Plastic Classic Grip Handle Sterile Disposable
1/2”-20 threaded rod	McMaster-Carr	99065A120	1/2”-20 threaded rod
10 mL syringe	McKesson	1031801	For irrigation; General Purpose Syringe McKesson 10 mL Blister Pack Luer Lock Tip Without Safety
3 mL syringe	McKesson	1031804	For lidocaine/bupiviacaine injection; General Purpose Syringe McKesson 3 mL Blister Pack Luer Lock Tip Without Safety.
3-0 polysorb	Ethicon	J332H	3-0 Vircryl, CT-2, 1/2 circle, 26 mm, tapered
4-0 monosorb	Ethicon	Z397H	4-0 PDS 2, FS-2, 3/8 circle, 19mm, cutting edge
5-0 polysorb	Med Vet International	NC9335902	Med Vet International 5-0 ETHICON COATED VICRYL C-3
Accelerometer	Kistler	8743A5	Accelerometer
Adson-Browns Forceps	World precision tools	500177	Adson-Brown Forceps, 12 cm, Straight, TC Jaws, 7 x 7 Teeth
Alfaxalone	Jurox	49480-002-01	Alfaxan Multidose by Jurox : 10 mg/mL
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals	42023-0179-05	Buprenorphine HCL injection: 0.3 mg/mL
Butorphanol	Zoetis	54771-2033	Butorphanol tartrate 10mg/ml by Zoetis
Chlorhexidine Hand Scrub	BD	371073	BD E-Z Scrub 107 Surgical Scrub Brush/Sponge, 4% CHG, Red
Collet	STRYKER	14023	Stryker 4100-62 wire Collet 0.28-0.71''
Cordless Driver handpiece	STRYKER	OR-S4300	Stryker 4300 CD3 Cordless Driver 3 handpiece
Cricket Retractors	Novosurgical	G3510 21	2x Heiss (Holzheimer) Cross Action Retractor
Dissector Scissors	Jorvet labs	J0662	Aesculap AG, Metzenbaum, Scissors, Straight 5 3/4″
Elizabethian Collar	ElizaSoft	62054	ElizaSoft Elizabethan Recovery Collar
Enrofloxacin	Custom Meds		Enrofloxacin compounded by Custom Meds
Eye Ointment	Pivetal	46066-753-55	Pivetal Articifical Tears- recently recalled
Face-mount shaft collar	McMaster-Carr	5631T11	Face-mount shaft collar
Fast green	Millipore Sigma	F7258	Fast green
Freer	Jorvet labs	J0226Q	Freer elevator
Head screw -1	McMaster-Carr	91251A197	Black-oxide alloy steel socket head screw, 8-32, 3/4"
Head screw -2	McMaster-Carr	92196A194	Stainless steel socket head screw, 8-32, 1/2"
Head screw -3	McMaster-Carr	92196A146	Stainless steel socket head screw, 8-32, 1/2"
Head screw -4	McMaster-Carr	92196A151	Stainless steel socket head screw, 6-32, 3/4"
Hematoxylin Solution, Gill No. 1	Millipore Sigma	GHS132-1L	Hematoxylin Solution, Gill No. 1
Hex nut	McMaster-Carr	91841A007	Stainless steel hex nut, 6-32
Hold-down toggle clamp	McMaster-Carr	5126A71	Hold-down toggle clamp
Impact device	n/a	n/a	custom made
Impact platform	n/a	n/a	custom made
K-wires	Jorvet Labs	J0250A	JorVet Intramedullary Steinman Pins, Trocar-Trocar 1/16" x 7"
Lab View	National Instruments	n/a	n/a
Load cell	Kistler	9712B5000	Load cell
MATLAB	The MathWorks Inc.	n/a	n/a
Microscope	Leica	DMi-8	Leica DMi8 microscope with LAS-X software
Midazolam	Almaject	72611-749-10	Midazolam Hydrochloride injection: 5mg/ml by Almaject
milling machine depth stops	McMaster-Carr	2949A71	Clamp-on milling machine depth stops
Mobile C-arm	Philips	718095	BV Pulsera, Mobile C-arm
Mounted linear ball bearing	McMaster-Carr	9338T7	Mounted linear ball bearing
Needle Driver	A2Z Scilab	A2ZTCIN39	TC Webster Needle Holder Smooth Jaws 5", Premium
Pentobarbital	Vortech	0298-9373-68	Pentobarbital 390 mg/mL by Vortech
Safranin O	Millipore Sigma	HT90432	Safranin O
Small Battery pack	STRYKER	NS014036	6212 Small Battery pack- 9.6 V
Steel rod, 2’	McMaster-Carr	89535K25	Steel rod, 2’
Sterile Saline	ICU Medical	6139-22	AquaLite Solution Pour Bottles, 250 mL
Stryker 6110-120 System 6 Battery Charger	STRYKER	OR-S6110-120
Surgical gloves	McKesson	1044729	Surgical Glove McKesson Perry Size 6.5 Sterile Pair Latex Extended Cuff Length Smooth Brown Not Chemo Approved
Surgical gown	McKesson	1104452	Non-Reinforced Surgical Gown with Towel McKesson Large Blue Sterile AAMI Level 3 Disposable
Suture scissors	Jorvet Labs	J0910SA	Super Cut Scissors, Mayo, Straight, 5 1/2″
TUNEL staining kit	ABP Bioscience	A049	TUNEL Chromogenic Apoptosis Detection Kit
Weitlaner Retractors	Fine Science Tools	17012-11	2x Weitlaner-Locktite Retractors