水凝胶形成过程中的剪切处理导致产生微凝胶悬浮液,这些悬浮液剪切薄,但在去除剪切力后迅速重组。这些材料已被用作生物打印复杂、充满细胞的结构的支撑基质。这里描述了用于制造支撑床和兼容生物墨水的方法。
Bhattacharjee等人于2015年首次报道了在生物打印过程中使用颗粒基质来支持部件,从那时起,已经开发了几种用于在3D生物打印中制备和使用支撑凝胶床的方法。本文描述了一种使用琼脂糖(称为流体凝胶)制造微凝胶悬浮液的工艺,其中颗粒的形成由凝胶化过程中的剪切力应用决定。这种处理产生精心定义的微观结构,随后的材料特性在化学和机械上赋予嵌入印刷介质的独特优势。其中包括在零剪切下表现为粘弹性固体状材料,限制长程扩散,并展示絮凝系统的特征剪切稀化行为。
然而,在去除剪切应力时,流体凝胶具有快速恢复其弹性特性的能力。这种缺乏滞后与前面提到的定义的微观结构直接相关;由于加工,颗粒界面处的反应性非凝胶聚合物链促进了颗粒间的相互作用 – 类似于魔术贴效应。这种弹性特性的快速恢复使低粘度生物材料能够生物打印高分辨率部件,因为支撑床的快速重整将生物墨水原 位捕获,保持其形状。此外,琼脂糖流体凝胶的优点是不对称的胶凝/熔融转变(凝胶温度~30°C,熔融温度 ~90°C)。琼脂糖的这种热滞后使得可以在没有支撑流体凝胶熔化的情况下原 位 打印和培养生物打印部件。该协议展示了如何制造琼脂糖流体凝胶,并演示了它们在悬浮层增材制造(SLAM)中支持一系列复杂水凝胶部件的生产。
水凝胶是用作细胞生长支持的完美材料1。根据所使用的材料,它们通过不影响细胞活力的温和机制凝胶2,3。高含水量(通常为>90%)意味着营养物质和氧气很容易扩散到物质中,细胞代谢的废物扩散出来4。因此,细胞活力已被证明可以保存超过1年5,现在有水凝胶用于储存或“暂停”细胞以供将来治疗使用的例子6。它们已广泛用于组织工程中,以生产组织样结构,但它们的使用往往受到难以控制材料结构和组成的限制。从历史上看,由于形成结构的聚合物基质的高含水量和低体积,水凝胶强度相对较低(相对于许多硬组织)。此外,许多凝胶化途径(热、电离、纤维生成)提供了相当缓慢的动力学,这意味着它们的机械性能往往随着时间的推移而稳定发展。除了互穿网络外,低机械刚度和缓慢的固化时间通常会导致生物油墨在沉积时无法自由站立,在最初挤出时容易“坍落”并失去清晰度。
为了克服这一关键问题,已经开发了嵌入式印刷技术,在印刷过程中提供支持,而结构的机械性能正在发展7,8。一旦凝胶的微观结构完全形成并且机械性能达到最佳,通常可以通过温和洗涤或熔化支撑相来去除支撑基质。这种方法的初步工作利用了粘性多聚体分散体,其中第二相分布在9中。最近,Bhattacharjee等人使用颗粒状卡波尔形式的凝胶来证明细胞阵列可以悬浮在支撑凝胶10中。随后,Hinton等人报道了将含有细胞的凝胶基材料挤出到由颗粒明胶11形成的微凝胶悬浮液组成的支撑床中。在挤出含细胞的水凝胶并随后固化后,通过温和加热支撑浴除去明胶,使明胶熔化。不幸的是,此过程仍然存在一些限制。例如,与胶原蛋白相比,明胶的化学结构(因此它是胶原蛋白的水解形式)使得其骨架上的许多化学部分可以与生物实体相互作用;因此,残余支持基质可能会干扰下游生物过程。此外,动物源性产品在寻求技术的可转化性时具有限制性。如果制造部件打算用于临床,或者即使它用于回答基本的生物学问题,这种表面污染可能会导致重大问题,这将带来挑战。
我们随后创造了一种改进的工艺,允许在支持基质内悬浮生产水凝胶,该基质在生理条件下不带电荷,由非动物材料形成。尽管该工艺可以与一系列生物聚合物载体一起使用,但琼脂糖提供了一种对生物相互作用呈惰性的材料,因为它是基于糖的,并且在生理pH12,13下带中性电荷。支撑材料不是破碎已经存在的凝胶,而是通过在凝胶14,15,16期间施加剪切力形成。这会产生一个颗粒基质,其表面表现出石斛状特征,并分散在未凝胶聚合物的二次基质中17,18。结果是一种具有有趣的材料特性19,20,21,22的材料,它可以以类似于先前报道的颗粒凝胶的方式剪切稀薄,但是当剪切力被去除时,粘度往往恢复得更快23。一旦挤出到支撑基质中的含细胞材料完全成熟,就可以在放入培养物之前通过温和搅拌去除支撑基质。已经表明,可以使用该过程来生产具有复杂结构的材料,并概括皮肤和骨软骨区域的生物结构23,24,25。该方法论文详细描述了如何制造支撑材料,并重点介绍了在各种复杂结构中使用的适当生物墨水。
考虑支撑床所用材料的选择
在开发阶段,支撑床需要各种特性。这些特性包括:i)保持足够的结构来悬浮挤出材料;ii) 剪切稀化能力,使打印头在支撑材料中自由移动;iii)快速重组(自愈特性),在沉积的生物墨水周围形成支撑;iv) 在室温和生理温度下均具有热稳定性;v)中性(即不带电)材料,在pH和电解质(离子种类和浓度)范围内相对生物惰性,防止与细胞和带电生物墨水相互作用;六)无毒;并且,vii)最好来自非动物来源。
尽管有许多生物聚合物材料保持了这些固有特性中的几个,并且能够在不符合所有这些特性的情况下执行悬浮的3D增材制造11,26,27,但这里的目的是生产一种支撑床,以克服与其他支持材料相关的某些实际问题。由于琼脂糖的化学性质,特别是当配制成颗粒流体凝胶时,可以获得所有这些特性。这使得支撑床可用于各种生物墨水23,24,25,28。事实上,材料的生物惰性提供了在整个培养过程中保持印刷结构原位的潜力,允许许多不同的生物墨水充分发育足够的时间尺度,而无需改变生物学。此外,颗粒、稀薄的性质使得易于从最终的印刷结构中去除,而无毒、非动物来源允许快速转化为临床,克服与伦理和监管要求相关的障碍。
生物油墨材料选择的注意事项
在直接挤出生物打印中,生物墨水沉积到2D打印床上。单体生物墨水溶液具有剪切稀化行为是有益的;然而,为了生产具有生理相关尺寸的高保真结构,它们必须具有低触变性并恢复到足够高的粘度,以便在沉积时形成固体细丝29,30,31。随着粘度的增加,挤出所需的压力要高得多,通常会对包封的细胞活力产生负面影响31,32。悬浮生物打印消除了这一限制,因为挤出的材料在整个交联过程中由悬浮浴支撑。这一发展极大地增加了可以使用的生物墨水配方的范围。例如,最近的研究表明,使用低浓度胶原蛋白溶液被打印成类似于心脏内部结构的高度复杂的几何形状33,34,35。在该方法中提到的应用中,嵌入印刷允许选择生物材料油墨以最好地复制其预期的生理环境,而不是为了印刷它们的能力。
结构尺寸的限制
在整个生物制造文献中,已经证明,由替代打印头技术驱动的不同类型的生物打印机可以纳入嵌入式制造技术。这里展示的技术没有什么不同,例如Senior等人所展示的基于气动微挤出的生物打印机(INKREDIBLE)和具有可控微阀的基于挤出的生物打印机(3D Discovery)23。尽管这使得可能已经拥有生物打印机的一系列用户可以使用该技术,但对结构可达到尺寸的限制最终取决于所讨论的生物打印机规格。最初,对大型结构生成的主要限制由打印床的大小,X,Y和Z轨迹的限制以及包含支撑流体凝胶的容器的尺寸定义。
分辨率限制
在制造复杂的微米级结构时,最终的分辨率高度依赖于打印机的精度(控制步长、挤出程度)、打印喷嘴的内径以及一系列可调软件参数,包括打印速度、打印压力和流速36。此外,控制液滴尺寸似乎对于促进高分辨率结构的生成至关重要,在具有可控微阀的挤出打印机中观察到最佳结果。最终,当所有参数都经过优化时,可以实现与挤出喷嘴的内径相匹配甚至小于的打印分辨率,沉积的长丝约为微米级37。然而,这取决于前面提到的所有打印参数的优化,并且分辨率可能会受到打印机制和精度的极大限制。例如,气动挤出似乎不允许与使用可控微阀的挤出相同的印刷分辨率。因此,实现最大打印分辨率可能会涉及成本问题,因为此类系统会大大增加用户的费用。
未来展望和潜力
目前,人们对使用悬浮制造工艺来生产包含嵌入式电池的复杂软结构非常感兴趣,并且无疑将在未来几年取得重大进展。在提高打印分辨率方面取得了持续的进步,尽管鉴于大多数生物系统能够在分子水平上重新排列自己,这有多必要还有待观察。虽然媒体感兴趣的焦点是使用3D打印组织在受伤或疾病后直接替代人体组织,但这些过程实现的任何强大的医疗程序都需要几年的时间38,39。这些复杂培养系统的影响更有可能是在筛选药物甚至用作工具,以增强我们对生物过程的理解38。特别是,发育生物学可以极大地受益于这里,对分子特殊沉积的精确控制将使研究人员能够探索多因素系统在组织发育过程中的作用。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢EPSRC(EP / L016346 / 1),MRC和博士培训联盟生物科学促进健康资助和支持这项工作。
3D Discovery Bioprinter | RegenHU | BIOFACTORY | Microvalve extrusion bioprinter |
Agarose | Merck | 9012-36-6 | Material used to create fluid gel support baths |
Benchtop autoclave | Prestige Medical | B8L75814 | Classic |
Brilliant Blue G | Merck | 6104-58-1 | Dye used to stain structures |
Calcium Chloride Dihydrate | Merck | 10035-04-8 | Used to reticulate printed structures |
Dexamethasone | Merck | D4902-25MG | Used in adipogenic media |
DMEM | Merck | D6429 | Cell culture media |
Duran bottle | Merck | Z305219 | glass bottle |
EVOS XL Core Imaging System | EVOS™ | AMEX1000 | Brightfield microscope with phase contrast |
FBS | Fisher Scientific | 10500-064 | Cell culture media supplement |
Gellan gum | Special Ingredients | 5060341112638 | Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model |
HEPES buffer | Merck | H9897-10PAK | Buffer for cell culture media |
Indomethacin | Merck | I7378 | Used in adipogenic media |
Isobutyl-methylxanthine (IBMX) | Merck | I7018-100MG | Used in adipogenic media |
Keratinocyte growth medium | Lonza | 00192060 | Used as media to culture keratinocytes |
Low Methoxy Pectin | CP Kelco | LM-5CS | Pectin used to make pectin/collagen blends |
Penicillin-streptomycin | Merck | P4333-100ML | Used to inhibit bacterial growth |
PureCol EZ Gel solution | Merck | 5074 | Collagen solution used to make alginate/collagen blends |
Sodium Alginate | Merck | 9005-38-3 | Alginate powder used to make alginate/collagen blends |
TrypLE select | Fisher Scientific | 12563011 | cell dissociation enzyme |
T75 Flasks | StarLab | CC7682-4175 | Used for culturing cells |