하이드로겔 형성 중 전단 처리는 전단력이 제거된 후 전단이 얇지만 빠르게 재구성되는 마이크로겔 현탁액의 생성을 초래합니다. 이러한 물질은 바이오프린팅 복합체, 세포 함유 구조의 지지 매트릭스로 사용되었습니다. 여기서는지지 베드 및 호환 가능한 바이오 잉크를 제조하는 데 사용되는 방법을 설명합니다.
바이오 프린팅 공정 중 부품을지지하기 위해 세분화 된 매트릭스를 사용하는 것은 Bhattacharjee et al. 2015 년에 그 이후로 3D 바이오 프린팅에서지지 겔 베드의 준비 및 사용을위한 몇 가지 접근법이 개발되었습니다. 이 논문은 아가로오스(유체 겔로 알려짐)를 사용하여 마이크로겔 현탁액을 제조하는 공정을 설명하며, 여기서 입자 형성은 겔화 동안 전단의 적용에 의해 제어됩니다. 이러한 처리는 화학적으로나 기계적으로 인쇄 매체를 매립하는 것과 같은 뚜렷한 이점을 부여하는 후속 재료 특성과 함께 신중하게 정의된 미세 구조를 생성합니다. 여기에는 제로 전단에서 점탄성 고체와 같은 물질로 거동하고, 장거리 확산을 제한하고, 응집 시스템의 특징적인 전단 희석 거동을 입증하는 것이 포함됩니다.
그러나 전단 응력을 제거하면 유체 겔은 탄성 특성을 빠르게 회복할 수 있습니다. 이러한 히스테리시스의 부족은 이전에 언급 된 정의 된 미세 구조와 직접적으로 관련이 있습니다. 가공으로 인해 입자 계면에서 반응성이 있는 비겔화 폴리머 사슬은 벨크로 효과와 유사한 입자 간 상호 작용을 촉진합니다. 이러한 탄성 특성의 빠른 회복은 저점도 생체 재료에서 고해상도 부품을 바이오프린팅할 수 있게 하며, 지지 베드의 빠른 개질은 바이오잉크를 제자리에 가두어 모양을 유지합니다. 또한, 아가로스 유체 겔의 장점은 비대칭 겔화/용융 전이(~30°C의 겔화 온도 및 ~90°C의 용융 온도)입니다. 아가로스의 이러한 열 히스테리시스는 지지 유체 겔이 녹지 않고 현장에서 바이오프린팅된 부분을 인쇄하고 배양하는 것을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 아가로스 유체 겔을 제조하는 방법을 보여주고 부유층 첨가제 제조(SLAM) 내에서 다양한 복합 하이드로겔 부품의 생산을 지원하기 위한 사용을 보여줍니다.
하이드로겔은 세포 성장을 위한 보조제로 사용하기에 완벽한 재료이다1. 사용되는 재료에 따라 세포 생존력을 손상시키지 않는 부드러운 메커니즘을 통해 겔화됩니다 2,3. 수분 함량이 높다는 것(일반적으로 >90%)은 영양소와 산소가 물질 속으로 쉽게 확산되고 세포 대사의 노폐물이 확산된다는 것을 의미한다4. 따라서 세포 생존율은1년을 초과하는 기간 동안 보존되는 것으로 나타났으며5, 현재 하이드로겔을 사용하여 향후 치료용으로 세포를 저장하거나 “일시 중지”하는 데 사용되는 사례가 있다6. 그들은 조직과 같은 구조의 생산을 위해 조직 공학에서 널리 사용되어 왔지만, 재료의 구조와 조성을 모두 제어하는 데 어려움이 있기 때문에 사용이 제한되는 경향이 있습니다. 역사적으로, 하이드로겔 강도는 (많은 경조직과 관련하여) 비교적 낮은데, 이는 구조를 형성하는 폴리머 매트릭스가 차지하는 높은 수분 함량과 낮은 부피로 인해. 또한, 겔화에 대한 많은 경로(열, 이온성, 섬유형성)는 상당히 느린 동역학을 제공하며, 이는 기계적 특성이 시간이 지남에 따라 꾸준히 발전하는 경향이 있음을 의미합니다. 상호 침투 네트워크를 제외하고, 낮은 기계적 강성과 느린 경화 시간으로 인해 바이오잉크가 증착 시 자립할 수 없는 경우가 많으며, 초기 압출 시 “슬럼프”가 발생하고 정의를 잃는 경향이 있습니다.
이러한 중요한 문제를 극복하기 위한 시도로서, 프린팅 동안 지지를 제공하는 임베디드 프린팅 기술이 개발되었으며, 구조물의 기계적 특성은 7,8을 개발하고 있다. 겔의 미세구조가 완전히 발달하고 기계적 특성이 최적에 도달하면, 지지체 매트릭스는 전형적으로 지지체상의 부드러운 세척 또는 용융을 통해 제거될 수 있다. 이 접근법에 대한 초기 연구는 2 차 상이 분포 된 점성 플루 로닉 분산을 활용했다9. 보다 최근에, Bhattacharjee et al. 과립화 카보폴 형태의 겔을 사용하여 세포 어레이가 지지 겔10에 현탁될 수 있음을 입증했습니다. 이어서, Hinton et al. 과립 젤라틴으로부터 형성된 마이크로겔 현탁액으로 구성된 지지층으로 세포를 함유하는 겔 기반 물질의 압출에 대해 보고하였다11. 세포-함유 하이드로겔의 압출 및 그 후의 경화 후, 젤라틴은 지지조의 부드러운 가열에 의해 제거되어, 젤라틴의 용융을 가능하게 하였다. 안타깝게도 이 프로세스에는 여전히 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 콜라겐과 비교하여 젤라틴의 화학 구조(결과적으로 가수분해된 형태의 콜라겐임)는 골격을 가로지르는 많은 화학적 부분이 생물학적 실체와 상호 작용할 수 있도록 합니다. 따라서, 잔류 지지 매트릭스는 다운스트림 생물학적 과정을 방해할 수 있다. 또한 동물 유래 제품은 기술의 번역 가능성을 고려할 때 제한적인 사용을 제기합니다. 제조된 부품이 임상적으로 사용되도록 의도된 경우, 또는 이러한 표면 오염이 심각한 문제를 일으킬 수 있는 근본적인 생물학적 질문에 답하는 데 사용되는 경우에도 문제가 발생합니다.
우리는 그 후 생리학적 조건에서 전하가 없고 비동물성 물질로 형성되는 지지 매트릭스 내에서 하이드로겔의 부유 제조를 허용하는 정제된 공정을 만들었습니다. 이 공정은 다양한 생체 고분자 지지체와 함께 사용될 수 있지만, 아가로스는 생리학적 pH12,13에서 당 기반이고 중성으로 하전되기 때문에 생물학적 상호작용에 불활성인 물질을 제공합니다. 이미 존재하는 겔을 단편화하는 것보다는, 지지체 물질은 겔화 동안 전단의 적용을 통해 형성된다(14,15,16). 이것은 표면에서 덴드론과 같은 특징을 나타내고 겔화되지 않은 중합체17,18의 2차 매트릭스에 분산되는 입자의 매트릭스를 생성합니다. 그 결과 흥미로운 재료 특성(19,20,21,22)을 갖는 물질이 생성되는데, 이는 이전에 보고된 과립 겔과 유사한 방식으로 전단할 수 있지만, 전단이 제거될 때 점도를 더 빠르게 회복하는 경향이 있다 23. 지지 매트릭스로 압출된 세포 함유 물질이 완전히 성숙되면 배양에 배치하기 전에 부드러운 교반을 통해 지지 매트릭스를 제거할 수 있습니다. 이 과정을 사용하여 복잡한 구조를 가진 물질을 생산하고 피부와 골 연골 부위 23,24,25의 생물학적 구조를 요약 할 수 있음이 밝혀졌습니다. 이 방법 논문은 지지 재료를 제조하는 방법을 자세히 설명하고 다양한 복잡한 구조 내에서 사용되는 적절한 바이오잉크를 강조합니다.
지지 침대에 사용되는 재료 선택 고려
개발 단계에서 지지 베드에 필요한 다양한 특성이 있었습니다. 이러한 특성은 다음을 포함한다: i) 압출된 재료를 현탁시키기에 충분한 구조를 유지하는 것; ii) 프린트 헤드가 지지 재료를 통해 자유롭게 이동할 수 있도록 하는 전단 박화 능력; iii) 증착된 바이오잉크 주위에 지지체를 형성하는 신속한 구조조정(자가 치유 특성); iv) 실온 및 생리학적 온도 모두에서 열적으로 안정하고; v) 다양한 pH 및 전해질(이온성 종 및 농도)에 걸쳐 상대적으로 생체 불활성인 중성(즉, 전하를 띠지 않은) 물질로, 세포 및 하전된 바이오잉크와의 상호작용을 방지합니다. vi) 무독성; 및, vii) 바람직하게는 비-동물 공급원이다.
이러한 고유 특성 중 몇 가지를 유지하는 많은 생체 고분자 재료가 있지만, 이러한 모든 특성 11,26,27을 준수하지 않고 부유 된 3D 첨가제 제조를 수행 할 수있는 능력으로, 여기서의 의도는 다른 지원 재료와 관련된 특정 실용적인 문제를 극복 할 수있는 지원 침대를 생산하는 것이 었습니다. 아가로스의 화학적 특성으로 인해, 특히 미립자 유체 겔로서 제형화될 때, 이들 모든 특성이 얻어질 수 있었다. 이를 통해 다양한 바이오잉크23,24,25,28에 걸쳐 사용할 수 있는 지지층이 가능해졌습니다. 실제로, 재료의 생체 불활성 특성은 배양 전반에 걸쳐 인쇄 된 구조를 현장에서 유지할 수있는 잠재력을 제공하여 생물학의 변화없이 다양한 바이오 잉크가 완전히 발달 할 수있는 충분한 시간 척도를 허용했습니다. 또한, 미립자, 희석 특성으로 인해 최종 인쇄 구조물에서 쉽게 제거 할 수 있으며, 무독성, 비 동물 기원은 윤리적 및 규제 요구 사항과 관련된 장벽을 극복하여 클리닉으로 신속하게 번역 할 수 있습니다.
바이오잉크 재료 선택에 대한 고려 사항
직접 압출 바이오 프린팅에서 바이오 잉크는 2D 프린트 베드에 증착됩니다. 모노머 바이오잉크 용액이 전단 희석 거동을 갖는 것이 유익합니다. 그러나, 생리학적으로 관련된 치수를 갖는 고충실도 구조물을 생산하기 위해서는, 이들은 낮은 요변성을 가져야 하고, 증착시 고체 필라멘트를 형성할 수 있도록 충분히 높은 점도로 회복되어야 한다 29,30,31. 점도가 증가함에 따라, 압출에 필요한 압력은 훨씬 더 높아져, 종종 캡슐화된 셀 생존율(31,32)에 부정적인 영향을 미친다. 현탁액 바이오프린팅은 압출된 재료가 가교 결합 전반에 걸쳐 현탁 수조에 의해 지지되기 때문에 이러한 제한을 제거합니다. 이러한 개발은 사용할 수 있는 바이오잉크 제형의 범위를 크게 증가시킵니다. 예를 들어, 최근의 연구는 저농도 콜라겐 용액의 사용이 심장의 내부 구조와 유사한 매우 복잡한 기하학으로 인쇄되는 것을 보여주었다33,34,35. 이 방법에서 언급 된 응용 분야에서 임베디드 인쇄를 통해 생체 재료 잉크는 인쇄 능력 대신 의도 된 생리적 환경을 가장 잘 복제하도록 선택할 수있었습니다.
구조 크기의 한계
바이오 제조 문헌 전반에 걸쳐, 대체 프린트 헤드 기술에 의해 구동되는 다양한 종류의 바이오 프린터가 임베디드 제조 기술에 통합 될 수 있음이 입증되었습니다. 여기에서 입증된 기술도 다르지 않으며, Senior et al.에 의해 입증된 공압식 마이크로 압출 기반 바이오프린터(INKREDIBLE)와 제어 가능한 마이크로밸브가 있는 압출 기반 바이오프린터(3D Discovery)23를 예로 들 수 있습니다. 이를 통해 이미 바이오 프린터를 소유하고있는 다양한 사용자가이 기술에 액세스 할 수 있지만, 달성 가능한 구조 크기에 대한 제한은 궁극적으로 해당 바이오 프린터 사양에 달려 있습니다. 초기에, 대형 구조물의 생성에 대한 주요 제한은 프린트 베드의 크기, X, Y 및 Z 궤적의 한계 및 지지 유체 겔이 함유된 용기의 크기에 의해 정의됩니다.
해상도의 한계
복잡한 마이크로미터 크기의 구조물을 제조할 때, 결과적인 분해능은 프린터의 정밀도(스텝 크기, 압출도에 대한 제어), 프린트 노즐의 내부 직경, 및 프린트 속도, 인쇄 압력 및 유속(36)을 포함하는 조정 가능한 소프트웨어 파라미터의 범위에 크게 의존한다. 또한 액적 크기에 대한 제어는 고분해능 구조의 생성을 촉진하는 데 중요한 것으로 보이며, 제어 가능한 마이크로 밸브가 있는 압출 프린터에서 최상의 결과가 관찰됩니다. 궁극적으로, 모든 파라미터가 최적화될 때, 인쇄 해상도는 마이크로미터 스케일(37) 정도의 증착된 필라멘트와 압출 노즐의 내경과 일치하거나 심지어 그보다 작게 달성될 수 있다. 그러나 이것은 앞서 언급한 모든 인쇄 매개변수의 최적화에 의존하며 해상도는 인쇄 메커니즘과 정밀도에 의해 상당히 제한될 수 있습니다. 예를 들어, 공압 압출은 제어 가능한 마이크로 밸브를 사용한 압출과 동일한 인쇄 해상도를 허용하지 않는 것으로 보입니다. 그러므로, 최대 인쇄 해상도를 달성하기 위한 잠재적인 비용 영향이 존재하는데, 이러한 시스템은 사용자에게 상당히 증가된 비용을 발생시키기 때문이다.
미래 전망 및 잠재력
현재로서는 임베디드 셀을 포함하는 복잡한 연질 구조의 생산을 허용하기 위해 중단된 제조 공정을 사용하는 데 많은 관심이 있으며 의심할 여지 없이 향후 몇 년 동안 상당한 발전이 있을 것입니다. 인쇄 해상도 개선에 대한 지속적인 발전이 주어지지만, 대부분의 생물학적 시스템이 분자 수준에서 스스로를 재배열할 수 있다는 점을 감안할 때 이것이 얼마나 필요할지는 두고 봐야 합니다. 미디어에 대한 관심의 초점은 부상이나 질병 후 인체 조직을 직접 대체하기 위해 3D 프린팅 조직을 사용하는 것이지만 이러한 프로세스를 통해 가능해진 강력한 의료 절차는 몇 년이 걸립니다38,39. 이러한 복잡한 배양 시스템의 영향은 생물학적 과정에 대한 이해를 높이기 위해 약물 스크리닝에 영향을 미치거나 도구로 사용될 가능성이 더 큽니다38. 특히, 발달 생물학은 분자의 특수 증착에 대한 정확한 제어를 통해 연구자가 조직 발달 과정에서 다인성 시스템의 역할을 탐구할 수 있는 여기에서 큰 이점을 얻을 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는이 작업에 자금을 지원하고 지원해 준 EPSRC (EP / L016346 / 1), MRC 및 Doctoral Training Alliance Biosciences for Health에 감사드립니다.
3D Discovery Bioprinter | RegenHU | BIOFACTORY | Microvalve extrusion bioprinter |
Agarose | Merck | 9012-36-6 | Material used to create fluid gel support baths |
Benchtop autoclave | Prestige Medical | B8L75814 | Classic |
Brilliant Blue G | Merck | 6104-58-1 | Dye used to stain structures |
Calcium Chloride Dihydrate | Merck | 10035-04-8 | Used to reticulate printed structures |
Dexamethasone | Merck | D4902-25MG | Used in adipogenic media |
DMEM | Merck | D6429 | Cell culture media |
Duran bottle | Merck | Z305219 | glass bottle |
EVOS XL Core Imaging System | EVOS™ | AMEX1000 | Brightfield microscope with phase contrast |
FBS | Fisher Scientific | 10500-064 | Cell culture media supplement |
Gellan gum | Special Ingredients | 5060341112638 | Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model |
HEPES buffer | Merck | H9897-10PAK | Buffer for cell culture media |
Indomethacin | Merck | I7378 | Used in adipogenic media |
Isobutyl-methylxanthine (IBMX) | Merck | I7018-100MG | Used in adipogenic media |
Keratinocyte growth medium | Lonza | 00192060 | Used as media to culture keratinocytes |
Low Methoxy Pectin | CP Kelco | LM-5CS | Pectin used to make pectin/collagen blends |
Penicillin-streptomycin | Merck | P4333-100ML | Used to inhibit bacterial growth |
PureCol EZ Gel solution | Merck | 5074 | Collagen solution used to make alginate/collagen blends |
Sodium Alginate | Merck | 9005-38-3 | Alginate powder used to make alginate/collagen blends |
TrypLE select | Fisher Scientific | 12563011 | cell dissociation enzyme |
T75 Flasks | StarLab | CC7682-4175 | Used for culturing cells |