हाइड्रोगेल गठन के दौरान कतरनी प्रसंस्करण के परिणामस्वरूप माइक्रोगेल निलंबन का उत्पादन होता है जो कतरनी बलों को हटाने के बाद कतरनी-पतला लेकिन तेजी से पुनर्गठन करता है। ऐसी सामग्रियों का उपयोग बायोप्रिंटिंग कॉम्प्लेक्स, सेल से लदी संरचनाओं के लिए सहायक मैट्रिक्स के रूप में किया गया है। यहां, सहायक बिस्तर और संगत बायोइंक के निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों का वर्णन किया गया है।
बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया के दौरान भागों का समर्थन करने के लिए दानेदार मैट्रिसेस का उपयोग पहली बार 2015 में भट्टाचार्जी एट अल द्वारा रिपोर्ट किया गया था, और तब से, 3 डी बायोप्रिंटिंग में सहायक जेल बेड की तैयारी और उपयोग के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। यह पेपर अगारोस (द्रव जैल के रूप में जाना जाता है) का उपयोग करके माइक्रोजेल निलंबन बनाने की एक प्रक्रिया का वर्णन करता है, जिसमें कण गठन गेलेशन के दौरान कतरनी के आवेदन से नियंत्रित होता है। इस तरह के प्रसंस्करण सावधानीपूर्वक परिभाषित माइक्रोस्ट्रक्चर का उत्पादन करते हैं, जिसमें बाद के भौतिक गुण होते हैं जो रासायनिक और यांत्रिक रूप से प्रिंट मीडिया को एम्बेड करने के रूप में अलग-अलग फायदे प्रदान करते हैं। इनमें शून्य कतरनी पर विस्कोस्टिक ठोस जैसी सामग्री के रूप में व्यवहार करना, लंबी दूरी के प्रसार को सीमित करना और फ्लोकुलेटेड सिस्टम के विशिष्ट कतरनी-पतले व्यवहार का प्रदर्शन करना शामिल है।
कतरनी तनाव को हटाने पर, हालांकि, द्रव जैल में उनके लोचदार गुणों को तेजी से पुनर्प्राप्त करने की क्षमता होती है। हिस्टैरिसीस की यह कमी सीधे परिभाषित माइक्रोस्ट्रक्चर से जुड़ी हुई है जिसे पहले संदर्भित किया गया था; प्रसंस्करण के कारण, कण इंटरफ़ेस पर प्रतिक्रियाशील, गैर-गेल्ड बहुलक श्रृंखलाएं वेल्क्रो प्रभाव के समान इंटरपार्टिकल इंटरैक्शन की सुविधा प्रदान करती हैं। लोचदार गुणों की यह तेजी से वसूली कम-चिपचिपाहट बायोमैटेरियल्स से उच्च-रिज़ॉल्यूशन भागों को बायोप्रिंट करने में सक्षम बनाती है, क्योंकि सपोर्ट बेड का तेजी से सुधार बायोइंक को सीटू में फंसाता है, इसके आकार को बनाए रखता है। इसके अलावा, अगारोस द्रव जैल का एक लाभ असममित गेलिंग / पिघलने संक्रमण (~ 30 डिग्री सेल्सियस का गेलेशन तापमान और ~ 90 डिग्री सेल्सियस का पिघलने का तापमान) है। अगारोस का यह थर्मल हिस्टैरिसीस सहायक द्रव जेल पिघलने के बिना सीटू में बायोप्रिंटेड भाग को प्रिंट और कल्चर करना संभव बनाता है। यह प्रोटोकॉल दिखाता है कि अगारोस द्रव जैल का निर्माण कैसे किया जाए और निलंबित-परत योजक निर्माण (एसएलएएम) के भीतर जटिल हाइड्रोगेल भागों की एक श्रृंखला के उत्पादन का समर्थन करने के लिए उनके उपयोग को प्रदर्शित करता है।
हाइड्रोगेल सेल विकास के लिए समर्थन के रूप में उपयोग करने के लिए एकदम सही सामग्री हैं। उपयोग की जाने वाली सामग्री के आधार पर, वे कोमल तंत्र के माध्यम से जेल करते हैं जो सेल व्यवहार्यता 2,3 से समझौता नहीं करते हैं। उच्च जल सामग्री (आमतौर पर >90%) का मतलब है कि पोषक तत्व और ऑक्सीजन आसानी से सामग्री में फैल सकते हैं और सेल चयापचय के अपशिष्ट उत्पादफैल सकते हैं। जैसे, सेल व्यवहार्यता को 1 वर्ष5 से अधिक की अवधि के लिए संरक्षित दिखाया गया है, और अब भविष्य के चिकित्सीय उपयोग के लिए कोशिकाओं को स्टोर या “रोकने” के लिए हाइड्रोगेलका उपयोग करने के उदाहरण हैं। ऊतक जैसी संरचनाओं के उत्पादन के लिए ऊतक इंजीनियरिंग में उनका व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, लेकिन उनका उपयोग सामग्री की संरचना और संरचना दोनों को नियंत्रित करने में कठिनाई से सीमित होता है। ऐतिहासिक रूप से, हाइड्रोगेल की ताकत तुलनात्मक रूप से कम है (कई कठोर ऊतकों के संबंध में), संरचना बनाने वाले बहुलक मैट्रिक्स द्वारा कब्जा किए गए उच्च जल सामग्री और कम मात्रा के कारण। इसके अलावा, गेलेशन (थर्मल, आयोनोट्रोपिक, फाइब्रिलोजेनेसिस) के कई मार्ग काफी धीमी गति से कैनेटीक्स प्रदान करते हैं, जिसका अर्थ है कि उनके यांत्रिक गुण समय के साथ लगातार विकसित होते हैं। इंटरपेनिट्रेटिंग नेटवर्क के अपवाद के साथ, कम यांत्रिक कठोरता और धीमी गति से इलाज के समय के परिणामस्वरूप अक्सर बायोइंक होते हैं जो जमाव पर मुक्त होने में असमर्थ होते हैं, “मंदी” का इरादा रखते हैं और शुरू में एक्सट्रूडेड होने पर परिभाषा खो देते हैं।
इस प्रमुख मुद्दे को दूर करने के प्रयास में, एम्बेडेड प्रिंटिंग तकनीकों को विकसित किया गया है जो मुद्रण के दौरान सहायता प्रदान करते हैं, जबकि निर्माण के यांत्रिक गुण 7,8 विकसित हो रहे हैं। एक बार जब जेल का माइक्रोस्ट्रक्चर पूरी तरह से विकसित हो जाता है और यांत्रिक गुण इष्टतम तक पहुंच जाते हैं, तो समर्थन मैट्रिक्स को हटाया जा सकता है, आमतौर पर कोमल धोने या समर्थन चरण के पिघलने के माध्यम से। इस दृष्टिकोण पर प्रारंभिक कार्य में एक चिपचिपा प्लूरोनिक फैलाव का उपयोग किया गया था जिसमें द्वितीयक चरण9 वितरित किया गया था। हाल ही में, भट्टाचार्जी एट अल ने दानेदार कार्बोपोल के रूप में जैल का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया कि सहायक जेल10 में कोशिकाओं के सरणी को निलंबित किया जा सकता है। इसके बाद, हिंटन एट अल ने जेल-आधारित सामग्रियों के एक्सट्रूज़न पर एक समर्थन बिस्तर में कोशिकाओं की सूचना दी जिसमें दानेदार जिलेटिन11 से गठित माइक्रोगेल निलंबन शामिल था। सेल युक्त हाइड्रोगेल के एक्सट्रूज़न और इसके बाद के इलाज के बाद, जिलेटिन को समर्थन स्नान के कोमल हीटिंग द्वारा हटा दिया गया था, जिससे जिलेटिन पिघलने में सक्षम था। दुर्भाग्य से, यह प्रक्रिया अभी भी कई सीमाएं प्रस्तुत करती है। उदाहरण के लिए, कोलेजन की तुलना में जिलेटिन की रासायनिक संरचना (परिणामस्वरूप यह कोलेजन का हाइड्रोलाइज्ड रूप है) ऐसी है कि इसकी रीढ़ की हड्डी में कई रासायनिक गुण जैविक संस्थाओं के साथ बातचीत कर सकते हैं; इस प्रकार, एक अवशिष्ट समर्थन मैट्रिक्स डाउनस्ट्रीम जैविक प्रक्रियाओं में हस्तक्षेप कर सकता है। इसके अलावा, पशु-व्युत्पन्न उत्पाद एक तकनीक की हस्तांतरणीयता की ओर देखते समय प्रतिबंधात्मक उपयोग करते हैं। यह चुनौतियां पैदा करता है यदि निर्मित भाग को चिकित्सकीय रूप से उपयोग करने का इरादा है, या भले ही इसका उपयोग मौलिक जैविक प्रश्नों के उत्तर देने के लिए किया जाना है, जहां यह सतह संदूषण एक महत्वपूर्ण मुद्दा पैदा कर सकता है।
हमने बाद में एक परिष्कृत प्रक्रिया बनाई है जो एक सहायक मैट्रिक्स के भीतर हाइड्रोगेल के निलंबित निर्माण की अनुमति देती है, जिसमें शारीरिक परिस्थितियों के तहत कोई शुल्क नहीं है और गैर-पशु सामग्री से बनता है। यद्यपि प्रक्रिया का उपयोग बायोपॉलीमेरिक समर्थन की एक श्रृंखला के साथ किया जा सकता है, अगारोस एक ऐसी सामग्री प्रदान करता है जो जैविक बातचीत के लिए निष्क्रिय है क्योंकि यह चीनी आधारित है और शारीरिक पीएच12,13 पर तटस्थ रूप से चार्ज किया जाता है। पहले से मौजूद जेल को खंडित करने के बजाय, समर्थन सामग्रीगेलेशन 14,15,16 के दौरान कतरनी के आवेदन के माध्यम से बनती है। यह कणों का एक मैट्रिक्स पैदा करता है जो उनकी सतह पर डेंड्रोन जैसी विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं और अनजेल्ड बहुलक17,18 के द्वितीयक मैट्रिक्स में फैले होते हैं। परिणाम 19,20,21,22 दिलचस्प सामग्री गुणों वाली एक सामग्री है जो पहले रिपोर्ट किए गए दानेदार जैल के समान तरीके से कतरनी-पतली हो सकती है, लेकिनकतरनी को हटाने पर चिपचिपाहट को अधिक तेजी से ठीक करती है। एक बार जब सहायक मैट्रिक्स में बाहर निकाली गई सेल-असर सामग्री पूरी तरह से परिपक्व हो जाती है, तो समर्थन मैट्रिक्स को संस्कृति में रखे जाने से पहले कोमल आंदोलन के माध्यम से हटाया जा सकता है। यह दिखाया गया है कि जटिल संरचनाओं के साथ सामग्री का उत्पादन करने और त्वचा और ओस्टियोकॉन्ड्रल क्षेत्र23,24,25 दोनों की जैविक संरचनाओं को पुन: उत्पन्न करने के लिए इस प्रक्रिया का उपयोग करना संभव है। यह विधि पेपर विस्तार से वर्णन करता है कि सहायक सामग्री का निर्माण कैसे किया जाए और विभिन्न जटिल संरचनाओं के भीतर उपयोग किए जाने वाले उपयुक्त बायोइंक पर प्रकाश डाला जाए।
सहायक बिस्तर के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्रियों के चयन पर विचार
विकास चरण के दौरान, सहायक बिस्तर की विभिन्न विशेषताओं की आवश्यकता थी। इन विशेषताओं में शामिल हैं: i) एक्सट्रूडेड सामग्री को निलंबित करने के लिए पर्याप्त संरचना बनाए रखना; ii) प्रिंटहेड को सहायक सामग्री के माध्यम से स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति देने के लिए कतरनी पतली क्षमता; iii) तेजी से पुनर्गठन (आत्म-उपचार गुण), जमा बायोइंक के आसपास समर्थन बनाना; iv) कमरे के तापमान और शारीरिक तापमान दोनों पर थर्मल रूप से स्थिर; v) तटस्थ (यानी, अनचार्ज्ड) सामग्री जो पीएच और इलेक्ट्रोलाइट्स (आयनिक प्रजातियों और सांद्रता) की एक श्रृंखला में अपेक्षाकृत बायोइनर्ट है, कोशिकाओं और चार्ज बायोइंक के साथ बातचीत को रोकती है; vi) गैर विषैले; और, vii) अधिमानतः एक गैर-पशु स्रोत से।
यद्यपि कई बायोपॉलिमर सामग्री हैं जो इन अंतर्निहित विशेषताओं में से कई को बनाए रखती हैं, इन सभी विशेषताओं 11,26,27 के अनुरूप निलंबित 3 डी योजक निर्माण करने की क्षमता के साथ, यहां इरादा एक सहायक बिस्तर का उत्पादन करना था जो अन्य सहायक सामग्रियों से जुड़े कुछ व्यावहारिक मुद्दों को दूर करेगा। अगारोस के रासायनिक गुणों के कारण और विशेष रूप से, जब कण द्रव जेल के रूप में तैयार किया जाता है, तो इन सभी विशेषताओं को प्राप्त किया जा सकता है। इसने एक सहायक बिस्तर को सक्षम किया जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार के बायोइंक 23,24,25,28 में किया जा सकता है। दरअसल, सामग्री की जैवअक्षर प्रकृति ने पूरे संस्कृति में सीटू में मुद्रित संरचना को बनाए रखने की क्षमता प्रदान की, जिससे जीव विज्ञान में बदलाव के बिना कई अलग-अलग बायोइंक को पूरी तरह से विकसित करने के लिए पर्याप्त टाइमस्केल की अनुमति मिली। इसके अलावा, कण, पतली प्रकृति ने अंतिम मुद्रित निर्माण से हटाने में आसानी की अनुमति दी, जबकि गैर विषैले, गैर-पशु मूल नैतिक और नियामक आवश्यकताओं से संबंधित बाधाओं पर काबू पाने के लिए क्लिनिक की ओर तेजी से अनुवाद की क्षमता की अनुमति देता है।
बायोइंक के लिए सामग्री के चयन में विचार
डायरेक्ट-एक्सट्रूज़न बायोप्रिंटिंग में, बायोइंक को 2 डी प्रिंट बेड पर जमा किया जाता है। यह फायदेमंद है कि मोनोमर बायोइंक समाधानों में कतरनी-पतला व्यवहार होता है; हालांकि, शारीरिक रूप से प्रासंगिक आयामों के साथ उच्च-निष्ठा संरचनाओं का उत्पादन करने के लिए, उनके पास कम थिक्सोट्रोपी होना चाहिए और पर्याप्त रूप से उच्च चिपचिपाहट तक ठीक होना चाहिए ताकि वेजमाव पर ठोस फिलामेंट्स बना सकें। बढ़ी हुई चिपचिपाहट के साथ, एक्सट्रूज़न के लिए आवश्यक दबाव बहुत अधिक है, अक्सर एनकैप्सुलेटेड सेल व्यवहार्यता31,32 को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है। सस्पेंशन बायोप्रिंटिंग इस सीमा को हटा देता है, क्योंकि एक्सट्रूडेड सामग्री को क्रॉसलिंकिंग के दौरान निलंबन स्नान द्वारा समर्थित किया जाता है। यह विकास बायोइंक योगों की सीमा को काफी बढ़ाता है जिनका उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हाल के काम ने कम सांद्रता वाले कोलेजन समाधानों के उपयोग को हृदय की आंतरिक संरचना 33,34,35 के अनुरूप अत्यधिक जटिल ज्यामिति में मुद्रित किया है। इस पद्धति में उल्लिखित अनुप्रयोगों में, एम्बेडेड प्रिंटिंग ने बायोमटेरियल स्याही को शारीरिक वातावरण को सर्वोत्तम रूप से दोहराने के लिए चुनने की अनुमति दी, जिसके लिए उनका इरादा था, बजाय उनके मुद्रित होने की क्षमता के लिए।
संरचना के आकार में सीमाएं
बायोफैब्रिकेशन साहित्य के दौरान, यह प्रदर्शित किया गया है कि वैकल्पिक प्रिंटहेड प्रौद्योगिकियों द्वारा संचालित विभिन्न प्रकार के बायोप्रिंटर को एम्बेडेड विनिर्माण तकनीकों में शामिल किया जा सकता है। यहां प्रदर्शित तकनीक अलग नहीं है, उदाहरणों के साथ जिसमें एक वायवीय माइक्रो-एक्सट्रूज़न-आधारित बायोप्रिंटर (INKREDIBLE) शामिल है, जैसा कि सीनियर एट अल द्वारा प्रदर्शित किया गया है, और नियंत्रणीय माइक्रोवाल्व्स (3 डी डिस्कवरी) 23 के साथ एक्सट्रूज़न-आधारित बायोप्रिंटर। यद्यपि यह तकनीक को उन उपयोगकर्ताओं की एक श्रृंखला के लिए सुलभ बनाता है जो पहले से ही बायोप्रिंटर के मालिक हो सकते हैं, संरचना के प्राप्य आकार पर सीमाएं अंततः बायोप्रिंटर विनिर्देशों पर निर्भर हैं। प्रारंभ में, बड़ी संरचनाओं की पीढ़ी पर मुख्य प्रतिबंध को प्रिंट बेड के आकार, एक्स, वाई और जेड प्रक्षेपवक्रों की सीमाओं और उस पोत के आकार से भी परिभाषित किया जाता है जिसमें सहायक द्रव जेल निहित होता है।
समाधान में सीमाएं
जटिल, माइक्रोमीटर आकार की संरचनाओं का निर्माण करते समय, परिणामी रिज़ॉल्यूशन प्रिंटर की सटीकता (चरण आकार पर नियंत्रण, एक्सट्रूज़न की डिग्री), प्रिंट नोजल के आंतरिक व्यास और प्रिंट गति, प्रिंट दबाव और प्रवाह वेग36 सहित समायोज्य सॉफ़्टवेयर मापदंडों की एक श्रृंखला पर अत्यधिक निर्भर होता है। इसके अलावा, ड्रॉपलेट आकार पर नियंत्रण उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं की पीढ़ी को सुविधाजनक बनाने के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है, जिसमें नियंत्रणीय माइक्रोवाल्व के साथ एक्सट्रूज़न प्रिंटर में सबसे अच्छे परिणाम देखे जाते हैं। अंततः, जब सभी मापदंडों को अनुकूलित किया जाता है, तो माइक्रोमीटर स्केल37 के क्रम पर जमा फिलामेंट के साथ, एक्सट्रूज़न नोजल के आंतरिक व्यास से मेल खाने के लिए प्रिंट रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया जा सकता है, या उससे भी कम हो सकता है। हालांकि, यह पहले उल्लिखित सभी मुद्रण मापदंडों के अनुकूलन पर निर्भर है, और रिज़ॉल्यूशन मुद्रण तंत्र और परिशुद्धता द्वारा काफी सीमित हो सकता है। उदाहरण के लिए, वायवीय एक्सट्रूज़न, एक नियंत्रणीय माइक्रोवाल्व के साथ एक्सट्रूज़न के समान मुद्रण संकल्प की अनुमति नहीं देता है। इसलिए, अधिकतम मुद्रण संकल्प प्राप्त करने के लिए एक संभावित लागत निहितार्थ है, क्योंकि ऐसे सिस्टम उपयोगकर्ता के लिए काफी अधिक खर्च उठाते हैं।
भविष्य का दृष्टिकोण और क्षमता
फिलहाल, एम्बेडेड कोशिकाओं वाले जटिल नरम संरचनाओं के उत्पादन की अनुमति देने के लिए निलंबित विनिर्माण प्रक्रियाओं के उपयोग के आसपास बहुत रुचि है, और आने वाले वर्षों में निस्संदेह महत्वपूर्ण प्रगति होगी। प्रिंट रिज़ॉल्यूशन में सुधार करने में निरंतर प्रगति दी गई है, हालांकि यह देखा जाना बाकी है कि यह कितना आवश्यक होगा, यह देखते हुए कि अधिकांश जैविक प्रणालियां आणविक स्तर पर खुद को पुनर्व्यवस्थित करने में सक्षम हैं। जबकि मीडिया में रुचि का ध्यान चोट या बीमारी के बाद सीधे मानव ऊतकों को बदलने के लिए 3 डी मुद्रित ऊतकों के उपयोग के आसपास है, इन प्रक्रियाओं द्वारा सक्षम कोई भी मजबूत चिकित्सा प्रक्रिया कुछ साल दूर है। यह अधिक संभावना है कि इन जटिल संस्कृति प्रणालियों का प्रभाव दवाओं की स्क्रीनिंग में होगा या यहां तक कि जैविक प्रक्रियाओं की हमारी समझ को बढ़ाने के लिए उपकरण के रूप में भी उपयोग कियाजाएगा। विशेष रूप से, विकासात्मक जीव विज्ञान यहां बहुत लाभ उठा सकता है, जहां अणुओं के विशेष जमाव पर सटीक नियंत्रण शोधकर्ताओं को ऊतक विकास प्रक्रियाओं पर बहुक्रियाशील प्रणालियों की भूमिका का पता लगाने की अनुमति देगा।
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस काम को वित्त पोषित करने और समर्थन करने के लिए ईपीएसआरसी (ईपी / एल016346/1), एमआरसी और डॉक्टरेट ट्रेनिंग एलायंस बायोसाइंसेज फॉर हेल्थ को धन्यवाद देना चाहते हैं।
3D Discovery Bioprinter | RegenHU | BIOFACTORY | Microvalve extrusion bioprinter |
Agarose | Merck | 9012-36-6 | Material used to create fluid gel support baths |
Benchtop autoclave | Prestige Medical | B8L75814 | Classic |
Brilliant Blue G | Merck | 6104-58-1 | Dye used to stain structures |
Calcium Chloride Dihydrate | Merck | 10035-04-8 | Used to reticulate printed structures |
Dexamethasone | Merck | D4902-25MG | Used in adipogenic media |
DMEM | Merck | D6429 | Cell culture media |
Duran bottle | Merck | Z305219 | glass bottle |
EVOS XL Core Imaging System | EVOS™ | AMEX1000 | Brightfield microscope with phase contrast |
FBS | Fisher Scientific | 10500-064 | Cell culture media supplement |
Gellan gum | Special Ingredients | 5060341112638 | Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model |
HEPES buffer | Merck | H9897-10PAK | Buffer for cell culture media |
Indomethacin | Merck | I7378 | Used in adipogenic media |
Isobutyl-methylxanthine (IBMX) | Merck | I7018-100MG | Used in adipogenic media |
Keratinocyte growth medium | Lonza | 00192060 | Used as media to culture keratinocytes |
Low Methoxy Pectin | CP Kelco | LM-5CS | Pectin used to make pectin/collagen blends |
Penicillin-streptomycin | Merck | P4333-100ML | Used to inhibit bacterial growth |
PureCol EZ Gel solution | Merck | 5074 | Collagen solution used to make alginate/collagen blends |
Sodium Alginate | Merck | 9005-38-3 | Alginate powder used to make alginate/collagen blends |
TrypLE select | Fisher Scientific | 12563011 | cell dissociation enzyme |
T75 Flasks | StarLab | CC7682-4175 | Used for culturing cells |