Summary

Modélisation du développement cérébelleux humain in vitro en structure 2D

Published: September 16, 2022
doi:

Summary

Le présent protocole explique la génération d’une monocouche 2D de cellules cérébelleuses à partir de cellules souches pluripotentes induites pour étudier les premiers stades du développement cérébelleux.

Abstract

Le développement précis et opportun du cervelet est crucial non seulement pour une coordination motrice et un équilibre précis, mais aussi pour la cognition. En outre, la perturbation du développement cérébelleux a été impliquée dans de nombreux troubles neurodéveloppementaux, notamment l’autisme, le trouble déficitaire de l’attention avec hyperactivité (TDAH) et la schizophrénie. Les études sur le développement cérébelleux chez l’homme n’étaient auparavant possibles que par des études post-mortem ou la neuroimagerie, mais ces méthodes ne sont pas suffisantes pour comprendre les changements moléculaires et cellulaires qui se produisent in vivo au cours du développement précoce, qui est à l’origine de nombreux troubles neurodéveloppementaux. L’émergence de techniques pour générer des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) à partir de cellules somatiques et la capacité de redifférencier davantage les CSPi en neurones ont ouvert la voie à la modélisation in vitro du développement précoce du cerveau. La présente étude fournit des étapes simplifiées vers la génération de cellules cérébelleuses pour des applications nécessitant une structure monocouche en 2 dimensions (2D). Les cellules cérébelleuses représentant les premiers stades de développement sont dérivées de CSPi humaines via les étapes suivantes: premièrement, les corps embryoïdes sont fabriqués en culture 3 dimensions (3D), puis ils sont traités avec FGF2 et insuline pour promouvoir la spécification du devenir cérébelleux, et enfin, ils sont différenciés en phase terminale en tant que monocouche sur des substrats recouverts de poly-l-ornithine (PLO) / laminine. À 35 jours de différenciation, les cultures de cellules cérébelleuses dérivées de l’iPSC expriment des marqueurs cérébelleux, notamment ATOH1, PTF1α, PAX6 et KIRREL2, ce qui suggère que ce protocole génère des précurseurs neuronaux cérébelleux glutamatergiques et GABAergiques, ainsi que des progéniteurs cellulaires de Purkinje. De plus, les cellules différenciées présentent une morphologie neuronale distincte et sont positives pour les marqueurs d’immunofluorescence de l’identité neuronale tels que TUBB3. Ces cellules expriment des molécules de guidage axonal, y compris la sémaphorine-4C, la plexine-B2 et la neuropiline-1, et pourraient servir de modèle pour étudier les mécanismes moléculaires de la croissance des neurites et de la connectivité synaptique. Cette méthode génère des neurones cérébelleux humains utiles pour des applications en aval, y compris l’expression génique, les études physiologiques et morphologiques nécessitant des formats monocouches 2D.

Introduction

Comprendre le développement cérébelleux humain et les fenêtres temporelles critiques de ce processus est important non seulement pour décoder les causes possibles des troubles neurodéveloppementaux, mais aussi pour identifier de nouvelles cibles pour une intervention thérapeutique. La modélisation du développement cérébelleux humain in vitro a été difficile, mais au fil du temps, de nombreux protocoles différenciant les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ou les CSPi avec le destin de la lignée cérébelleuse ont émergé 1,2,3,4,5,6,7,8 . De plus, il est important de développer des protocoles qui génèrent des résultats reproductibles, qui sont relativement simples (pour réduire les erreurs) et qui ne sont pas lourds en coûts monétaires.

Les premiers protocoles de différenciation cérébelleuse ont été générés à partir de cultures 2D de corps embryoïdes plaqués (EB), induisant le devenir cérébelleux avec divers facteurs de croissance similaires au développement in vivo, y compris WNT, BMP et FGF 1,9. Des protocoles publiés plus récents ont induit une différenciation principalement dans la culture organoïde 3D avec FGF2 et insuline, suivie de FGF19 et SDF1 pour les structures rhombiques ressemblant à des lèvres3,4, ou ont utilisé une combinaison de FGF2, FGF4 et FGF85. Les deux méthodes d’induction organoïde cérébelleuse ont abouti à des organoïdes cérébelleux 3D similaires, car les deux protocoles ont rapporté une expression similaire du marqueur cérébelleux à des moments identiques. Holmes et Heine ont étendu leur protocole 3D5 pour montrer que les cellules cérébelleuses 2D peuvent être générées à partir d’hESCs et d’iPSCs, qui commencent sous forme d’agrégats 3D. En outre, Silva et al.7 ont démontré que les cellules représentant des neurones cérébelleux matures en 2D peuvent être générées avec une approche similaire à celle de Holmes et Heine, en utilisant un point temporel différent pour passer de la 3D à la 2D et prolonger le temps de croissance et de maturation.

Le protocole actuel induit le devenir cérébelleux dans les CSPi sans alimentation en générant des corps embryoïdes flottants à l’aide d’insuline et de FGF2, puis en plaquant les EB sur des plats enrobés de PLOL / laminine au jour 14 pour une croissance et une différenciation 2D. Au jour 35, les cellules ayant une identité cérébelleuse sont obtenues. La capacité de récapituler les premières étapes du développement cérébelleux, en particulier dans un environnement 2D, permet aux chercheurs de répondre à des questions spécifiques nécessitant des expériences avec une structure monocouche. Ce protocole se prête également à d’autres modifications telles que des surfaces micropatternées, des tests de croissance axonale et le tri cellulaire pour enrichir les populations cellulaires souhaitées.

Protocol

La recherche sur des sujets humains a été approuvée sous le numéro d’approbation 201805995 du comité d’examen institutionnel de l’Université de l’Iowa et le numéro d’approbation 2017-02 du comité des cellules souches pluripotentes humaines de l’Université de l’Iowa. Des biopsies cutanées ont été obtenues des sujets après avoir obtenu un consentement éclairé écrit. Les fibroblastes ont été cultivés dans du DMEM avec 15% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de solution d’acides aminés MEM …

Representative Results

Vue d’ensemble de la différenciation cérébelleuse 3D à 2DLes cellules cérébelleuses sont générées à partir des CSPi. La figure 1A montre le flux de travail global et l’ajout de composants majeurs pour la différenciation. Le jour 0, les EB sont fabriqués en soulevant doucement les colonies d’iPSC (Figure 1B) à l’aide d’une pipette en verre tiré dans CDM contenant SB431542 et Y-27632 et placés dans des plaques de fixat…

Discussion

La capacité de modéliser le développement cérébelleux humain in vitro est importante pour la modélisation de la maladie ainsi que pour approfondir la compréhension du développement normal du cerveau. Des protocoles moins compliqués et moins rentables créent plus d’opportunités pour la génération de données reproductibles et une large mise en œuvre dans plusieurs laboratoires scientifiques. Un protocole de différenciation cérébelleuse est décrit ici en utilisant une méthode modifiée de gén…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Jenny Gringer Richards pour son travail approfondi dans la validation de nos sujets témoins, à partir desquels nous avons généré les CSPi de contrôle. Ce travail a été soutenu par NIH T32 MH019113 (à D.A.M. et K.A.K.), le Nellie Ball Trust (à T.H.W. et A.J.W.), NIH R01 MH111578 (à V.A.M. et J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (à A.J.W.) et le Roy J. Carver Charitable Trust (à V.A.M., J.A.W. et A.J.W.). Les figurines ont été créées avec BioRender.com.

Materials

10 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26D
1-thio-glycerol Sigma M6145
2 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia Fisher Scientific FB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish Falcon 353001
4D Nucleofector core unit Lonza 276885 Nucleofector
5 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish Falcon 353004
6-well ultra-low attachment plates Corning 3471
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Apo-transferrin Sigma T1147
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9418
Cell culture grade water Cytiva SH30529.02
Chemically defined lipid concentrate Gibco 11905031
Chroman 1 Cayman 34681
Class II, Type A2, Biological safety Cabinet NuAire, Inc. NU-540-600 Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treated Corning 3526
Costar 6-well plate, TC treated Corning 3516
DAPI solution Thermo Scientific 62248
DMEM Gibco 11965092
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide) Sigma D2438
DPBS+/+ Gibco 14040133
Emricasan Cayman 22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kit Life Technologies A15960
Essential 8-Flex Gibco A2858501 PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging system Life Technologies AMEX1000
Fetal bovine serum – Premium Select Atlanta Biologicals S11150
FGF2 Peprotech 100-18B
GlutaMAX supplement Gibco 35050061 L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient Mix Gibco 11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific 50144906
Human Anti-EN2, mouse Santa Cruz Biotechnology sc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbit R&D Systems MAB7617
Human anti-PTF1a, rabbit Novus Biologicals NBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouse Biolegend 801213
IMDM Gibco 12440053
Insulin Gibco 12585
Laminin Mouse Protein Gibco 23017015
Matrigel Matrix Corning 354234 Basement membrane matrix
MEM-NEAA Gibco 11140050
Mini Centrifuge Labnet International C1310 Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) New England BioLabs T2040 Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep Kit New England BioLabs T2010 Silica spin columns
N-2 supplement Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103049
PBS, pH 7.4 Gibco 10010023
PFA 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Polyamine supplement Sigma P8483
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma 3655
Potassium chloride Sigma 746436
SB431542 Sigma 54317
See through self-sealable pouches Steriking SS-T2 (90×250) Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate  Fisher Scientific S279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia Research Products International 256131
Trans-ISRIB Cayman 16258
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018 Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x) Gibco 12604039 Cell dissociation reagent 
Vapor pressure osmometer Wescor, Inc. Model 5520 Osmometer
Y-27632 Biogems 1293823

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Madencioglu, D. A., Kruth, K. A., Wassink, T. H., Magnotta, V. A., Wemmie, J. A., Williams, A. J. Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure. J. Vis. Exp. (187), e64462, doi:10.3791/64462 (2022).

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