Modelagem do Desenvolvimento Cerebelar Humano In Vitro em Estrutura 2D
Summary
O presente protocolo explica a geração de uma monocamada 2D de células cerebelares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas para investigar os estágios iniciais do desenvolvimento cerebelar.
Abstract
O desenvolvimento preciso e oportuno do cerebelo é crucial não só para a coordenação motora precisa e equilíbrio, mas também para a cognição. Além disso, a interrupção no desenvolvimento cerebelar tem sido implicada em muitos distúrbios do neurodesenvolvimento, incluindo autismo, transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) e esquizofrenia. Investigações do desenvolvimento cerebelar em humanos anteriormente só foram possíveis através de estudos post-mortem ou neuroimagem, mas esses métodos não são suficientes para entender as mudanças moleculares e celulares que ocorrem in vivo durante o desenvolvimento inicial, que é quando muitos distúrbios do neurodesenvolvimento se originam. O surgimento de técnicas para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) a partir de células somáticas e a capacidade de rediferenciar ainda mais as iPSCs em neurônios abriram o caminho para a modelagem in vitro do desenvolvimento cerebral inicial. O presente estudo fornece passos simplificados para a geração de células cerebelares para aplicações que requerem uma estrutura monocamada 2-dimensional (2D). As células cerebelares que representam os estágios iniciais de desenvolvimento são derivadas de iPSCs humanas através das seguintes etapas: primeiro, os corpos embrionários são feitos em cultura tridimensional (3D), depois são tratados com FGF2 e insulina para promover a especificação do destino cerebelar e, finalmente, são terminalmente diferenciados como uma monocamada em substratos revestidos de poli-l-ornitina (PLO) / laminina. Aos 35 dias de diferenciação, as culturas de células cerebelares derivadas de iPSC expressam marcadores cerebelares, incluindo ATOH1, PTF1α, PAX6 e KIRREL2, sugerindo que esse protocolo gera precursores neuronais cerebelares glutamatérgicos e GABAérgicos, bem como progenitores de células de Purkinje. Além disso, as células diferenciadas apresentam morfologia neuronal distinta e são positivas para marcadores de imunofluorescência de identidade neuronal, como o TUBB3. Essas células expressam moléculas de orientação axonal, incluindo semaforina-4C, plexina-B2 e neuropilina-1, e poderiam servir de modelo para investigar os mecanismos moleculares de crescimento de neuritos e conectividade sináptica. Este método gera neurônios cerebelares humanos úteis para aplicações a jusante, incluindo expressão gênica, estudos fisiológicos e morfológicos que exigem formatos de monocamada 2D.
Introduction
Compreender o desenvolvimento cerebelar humano e as janelas de tempo críticas desse processo é importante não apenas para decodificar as possíveis causas dos distúrbios do neurodesenvolvimento, mas também para identificar novos alvos para a intervenção terapêutica. Modelar o desenvolvimento cerebelar humano in vitro tem sido um desafio, mas ao longo do tempo, muitos protocolos diferenciando células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ou iPSCs com destinos de linhagem cerebelar surgiram 1,2,3,4,5,6,7,8 . Além disso, é importante desenvolver protocolos que gerem resultados reprodutíveis, sejam relativamente simples (para reduzir o erro) e não sejam pesados em custos monetários.
Os primeiros protocolos de diferenciação cerebelar foram gerados a partir de culturas 2D de corpos embrionários banhados (EBs), induzindo o destino cerebelar com vários fatores de crescimento semelhantes ao desenvolvimento in vivo, incluindo WNT, BMPs e FGFs 1,9. Protocolos publicados mais recentemente induziram diferenciação principalmente em cultura organoide 3D com FGF2 e insulina, seguidos por FGF19 e SDF1 para estruturas rômbicas semelhantes a lábios3,4, ou usaram uma combinação de FGF2, FGF4 e FGF85. Ambos os métodos de indução de organoides cerebelares resultaram em organoides cerebelares 3D semelhantes, pois ambos os protocolos relataram expressão de marcadores cerebelares semelhantes em pontos de tempo idênticos. Holmes e Heine estenderam seu protocolo 3D5 para mostrar que as células cerebelares 2D podem ser geradas a partir de hESCs e iPSCs, que começam como agregados 3D. Além disso, Silva et al.7 demonstraram que células que representam neurônios cerebelares maduros em 2D podem ser geradas com uma abordagem semelhante a Holmes e Heine, usando um ponto de tempo diferente para mudar de 3D para 2D e estendendo o tempo de crescimento e maturação.
O protocolo atual induz o destino cerebelar em iPSCs livres de alimentadores, gerando corpos embrionários (EBs) flutuantes livres usando insulina e FGF2 e, em seguida, chapeando os EBs em pratos revestidos de OLP / laminina no dia 14 para crescimento e diferenciação 2D. No dia 35, as células com identidade cerebelar são obtidas. A capacidade de recapitular os estágios iniciais do desenvolvimento cerebelar, especialmente em um ambiente 2D, permite que os pesquisadores respondam a perguntas específicas que exijam experimentos com uma estrutura monocamada. Este protocolo também é passível de modificações adicionais, como superfícies micropadronizadas, ensaios de crescimento axonal e classificação celular para enriquecer as populações celulares desejadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A capacidade de modelar o desenvolvimento cerebelar humano in vitro é importante para a modelagem de doenças, bem como para promover a compreensão do desenvolvimento normal do cérebro. Protocolos menos complicados e econômicos criam mais oportunidades para a geração de dados replicáveis e ampla implementação em vários laboratórios científicos. Um protocolo de diferenciação cerebelar é descrito aqui usando um método modificado de geração de EBs que não requer enzimas ou agentes de dissociaçã…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Jenny Gringer Richards por seu trabalho minucioso na validação de nossos sujeitos de controle, a partir do qual geramos as iPSCs de controle. Este trabalho foi apoiado pelo NIH T32 MH019113 (para D.A.M. e K.A.K.), o Nellie Ball Trust (para T.H.W. e A.J.W.), NIH R01 MH111578 (para V.A.M. e J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (para A.J.W.), e o Roy J. Carver Charitable Trust (para V.A.M., J.A.W. e A.J.W.). As figuras foram criadas com BioRender.com.
Materials
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90×250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
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