القياس الكمي للحمض النووي الريبي الدائري باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بالقطرات الرقمية
Summary
يصف هذا البروتوكول الطريقة التفصيلية لتفاعل البوليميراز المتسلسل بالقطرات الرقمية (dd-PCR) من أجل التحديد الكمي الدقيق لمستويات الحمض النووي الريبي الدائري (circRNA) في الخلايا باستخدام بادئات متباينة.
Abstract
يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل للقطرات الرقمية (dd-PCR) أحد أكثر طرق القياس الكمي حساسية. يقسم التفاعل إلى ما يقرب من 20000 قطرة ماء في زيت ، ويحدث تفاعل البوليميراز المتسلسل في القطرات الفردية. يتميز تفاعل البوليميراز المتسلسل dd-PCR بالعديد من المزايا مقارنة ب qPCR التقليدي في الوقت الفعلي ، بما في ذلك زيادة الدقة في اكتشاف الأهداف منخفضة الوفرة ، وحذف الجينات المرجعية للقياس الكمي ، والقضاء على التكرارات التقنية للعينات ، وإظهار مرونة عالية للمثبطات في العينات. في الآونة الأخيرة ، أصبح dd-PCR أحد أكثر الطرق شيوعا لتحديد كمية الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المستهدف بدقة لتحليل التعبير الجيني والتشخيص. الحمض النووي الريبي الدائري (circRNAs) هي عائلة كبيرة من جزيئات الحمض النووي الريبي المغلقة تساهميا المكتشفة مؤخرا والتي تفتقر إلى نهايات 5 ‘و 3’. لقد ثبت أنها تنظم التعبير الجيني من خلال العمل كإسفنج للبروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي الميكروي. علاوة على ذلك ، يتم إفراز circRNAs في سوائل الجسم ، ومقاومتها للإكسونوكلياز تجعلها بمثابة مؤشرات حيوية لتشخيص المرض. تهدف هذه المقالة إلى توضيح كيفية إجراء تصميم التمهيدي المتباعد ، واستخراج الحمض النووي الريبي ، وتوليف الحمض النووي المكمل ، وتحليل dd-PCR لتحديد مستويات الحمض النووي الريبي الدائري المحدد (circRNA) بدقة في الخلايا. في الختام ، نوضح التحديد الكمي الدقيق ل circRNAs باستخدام dd-PCR.
Introduction
اكتشفت التطورات الحديثة في تقنيات تسلسل الحمض النووي الريبي والخوارزميات الحسابية الجديدة عضوا جديدا في العائلة المتنامية من الحمض النووي الريبي غير المشفر ، يسمى الحمض النووي الريبي الدائري (circRNA)1. كما يوحي الاسم ، فإن circRNAs هي عائلة من جزيئات الحمض النووي الريبي أحادية الشريط بدون نهايات حرة. يتم تشكيلها عن طريق الربط غير المتعارف عليه من الرأس إلى الذيل يسمى الربط الخلفي ، حيث ينضم موقع مستقبل لصق المنبع تساهميا مع موقع مانح لصق المصب لتشكيل دائرة RNA مستقرة 1,2. يمكن التوسط في هذه العملية من خلال عدة عوامل ، بما في ذلك عناصر Alu المتكررة المقلوبة الموجودة في المنبع والمصب من exons الدائرية ، أو يمكن التوسط فيها بواسطة بعض عوامل الربط أو بروتينات ربط الحمض النووي الريبي (RBPs)2,3. تصنف الحمض النووي الريبي الدائري المتولد حصريا من التسلسل الخارجي أو التسلسل الحلقي على أنه سيرك رنان خارجي و الحمض النووي الريبي الدائري أو الحمض النووي الريبي الدائري ، في حين أن بعض الحمض النووي الريبي الحلقي (EIcircRNAs)3,4. وظائف circRNAs متعددة الأوجه ، بما في ذلك الإسفنجة miRNA و / أو RBP ، وتنظيم النسخ ، وتنظيم الوظيفة الخلوية عن طريق الترجمة إلى الببتيدات3،5،6،7. أبرزت العديد من التقارير أهمية circRNAs في مختلف الأمراض والعمليات الفسيولوجية8. علاوة على ذلك ، فإن أنماط التعبير الخاصة بالأنسجة ومقاومة الهضم بالإكسونوكلياز تجعله علامة حيوية وظيفية لتشخيص المرض ويمكن استخدامه أيضا كهدف علاجي مناسب8. بالنظر إلى أهميتها في تنظيم الصحة والأمراض ، فإن القياس الكمي الدقيق لتعبير circRNA هو حاجة الساعة.
تم تطوير العديد من الطرق البيوكيميائية لتحديد كمية circRNAs في العينات البيولوجية9. واحدة من أكثر الطرق ملاءمة ومقبولة على نطاق واسع لقياس كمية circRNA هي النسخ العكسي متبوعا بتفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (RT-qPCR) باستخدام أزواج أولية متباينة10. ومع ذلك ، فإن غالبية circRNAs منخفضة الوفرة مقارنة ب mRNAs الخطية ، مما يجعل من الصعب تحديدها كميا11. للتغلب على هذه المشكلة ، سعينا إلى استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بالقطرات الرقمية (dd-PCR) لتحديد عدد circRNAs في عينة معينة بدقة. DD-PCR هي تقنية PCR متقدمة تتبع مبدأ الموائع الدقيقة. يولد قطرات مائية متعددة في الزيت ، ويحدث تفاعل البوليميراز المتسلسل في كل قطرة كتفاعل فردي12. يحدث التفاعل في قطرات فردية ويتم تحليله باستخدام قارئ قطرات ، والذي يعطي عدد القطرات الإيجابية أو السلبية للجين محل الاهتمام12. إنها التقنية الأكثر حساسية لتحديد الجين محل الاهتمام بدقة ، حتى لو كانت هناك نسخة واحدة فقط في عينة معينة. انخفاض الحساسية تجاه المثبطات ، وتحسين الدقة ، وحذف الجين المرجعي للقياس الكمي يجعله أكثر فائدة من qPCRالتقليدي 13،14،15. لقد تم استخدامه على نطاق واسع كأداة بحث وتشخيص للقياس الكمي المطلق للجين محل الاهتمام16,17. هنا ، نصف بروتوكول dd-PCR المفصل لقياس كمية circRNA في التمييز بين الأنابيب العضلية للفأر C2C12 وتكاثر الأرومات العضلية للفأر C2C12 باستخدام البادئات المتباينة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نمت أبحاث CircRNA في العقد الماضي مع اكتشاف تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية. نتيجة لذلك ، تم اعتباره جزيئا محتملا لعلاجات الحمض النووي الريبي المستقبلية. بالإضافة إلى ذلك ، من المعروف أنه يعمل كمؤشر حيوي في العديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية 4,8…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بتمويل داخلي من معهد علوم الحياة ، ومنحة أبحاث DBT (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018) ، وزمالة Wellcome Trust / DBT India Alliance [IA / I / 18/2/504017] الممنوحة لأماريش سي باندا. نشكر أعضاء المختبر الآخرين على تدقيق المقال.
Materials
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
- Chen, L. L., Yang, L. Regulation of circRNA biogenesis. RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).
- Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
- Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
- Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
- Panda, A. C., Xiao, J. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).
- Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. Emerging role of circular RNA-protein interactions. Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).
- Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
- Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
- Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Untergasser, A., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
- Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
- Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
- Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
- Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).
