כימות רנ"א מעגלי באמצעות טיפות דיגיטליות PCR
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השיטה המפורטת של טיפות דיגיטליות PCR (dd-PCR) לכימות מדויק של רמות RNA מעגלי (circRNA) בתאים באמצעות פריימרים מסתעפים.
Abstract
תגובת שרשרת פולימראז טיפות דיגיטלית (dd-PCR) היא אחת משיטות הכימות הרגישות ביותר; הוא מחלק את התגובה לכמעט 20,000 טיפות מים בשמן, וה-PCR מתרחש בטיפות הבודדות. ל-dd-PCR יש מספר יתרונות על פני qPCR קונבנציונלי בזמן אמת, כולל דיוק מוגבר באיתור מטרות בשפע נמוך, השמטת גני ייחוס לכימות, ביטול שכפולים טכניים לדגימות והפגנת עמידות גבוהה בפני מעכבים בדגימות. לאחרונה, dd-PCR הפך לאחת השיטות הפופולריות ביותר לכימות מדויק של דנ”א מטרה או RNA לצורך ניתוח ביטוי גנים ואבחון. רנ”א מעגלי (circRNAs) הם משפחה גדולה של מולקולות RNA סגורות קוולנטיות שהתגלו לאחרונה, חסרות קצוות של 5′ ו-3′. הודגם כי הם מווסתים את ביטוי הגנים על ידי כך שהם מתפקדים כספוגים עבור חלבונים קושרי RNA ומיקרו-רנ”א. יתר על כן, circRNAs מופרשים לנוזלי גוף, ועמידותם בפני אקסונוקלאזות גורמת להם לשמש כסמנים ביולוגיים לאבחון מחלות. מאמר זה נועד להראות כיצד לבצע תכנון פריימר מסתעף, מיצוי RNA, סינתזת cDNA וניתוח dd-PCR כדי לכמת במדויק רמות RNA מעגליות ספציפיות (circRNA) בתאים. לסיכום, אנו מדגימים את הכימות המדויק של circRNAs באמצעות dd-PCR.
Introduction
ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות ריצוף RNA ואלגוריתמים חישוביים חדשניים גילו חבר חדש במשפחה ההולכת וגדלה של רנ”א שאינם מקודדים, הנקראים RNA מעגלי (circRNA)1. כפי שהשם מרמז, circRNAs הם משפחה של מולקולות RNA חד-גדיליות ללא קצוות חופשיים. הם נוצרים על ידי שחבור לא-קנוני של ראש-לזנב הנקרא שחבור אחורי, שבו אתר מקבל השחבור במעלה הזרם מתחבר באופן קוולנטי עם אתר תורם השחבור במורד הזרם ויוצר מעגל RNA יציב 1,2. תהליך זה יכול להיות מתווך על ידי מספר גורמים, כולל אלמנטים חוזרים של Alu הפוכים הנמצאים במעלה הזרם ובמורד הזרם של אקסונים מעגליים, או יכול להיות מתווך על ידי כמה גורמי שחבור או חלבונים קושרי RNA (RBPs)2,3. רנ”א מעגלי שנוצר באופן בלעדי מהרצף האקסוני או האינטרוני מסווג כ-circRNA אקסוני ו-RNA אינטרוני מעגלי או ci-RNAs, בעוד שחלק מה-circRNAs האקסוניים שומרים על האינטרון ונקראים אקסון-אינטרון circRNAs (EIcircRNAs)3,4. הפונקציות של circRNA הן רבות פנים, כולל ספוג miRNA ו / או RBP, ויסות שעתוק, וויסות תפקוד התא על ידי תרגום לפפטידים 3,5,6,7. מספר דיווחים הדגישו את החשיבות של circRNAs במחלות שונות ובתהליכים פיזיולוגיים8. יתר על כן, דפוסי ביטוי ספציפיים לרקמות ועמידות לעיכול אקסונוקלאז הופכים אותו לסמן ביולוגי פונקציונלי לאבחון מחלות והוא יכול לשמש גם כיעד טיפולי מתאים8. בהתחשב בחשיבותו בוויסות הבריאות והמחלות, הכימות המדויק של ביטוי circRNA הוא צורך השעה.
מספר שיטות ביוכימיות פותחו לכימות circRNAs בדגימות ביולוגיות9. אחת השיטות הנוחות והמקובלות ביותר לכימות circRNA היא שעתוק הפוך ואחריו תגובת שרשרת פולימראז כמותית (RT-qPCR) באמצעות זוגות פריימרים מסתעפים10. עם זאת, רוב ה-circRNAs נמצאים בשפע נמוך בהשוואה ל-mRNAs ליניאריים, מה שמקשה לכמת אותם11. כדי להתגבר על בעיה זו, ביקשנו להשתמש בטיפות דיגיטליות PCR (dd-PCR) כדי לכמת את מספר ה-circRNAs בדגימה נתונה באופן מדויק. ה- dd-PCR היא טכנולוגיית PCR מתקדמת הפועלת על פי עקרון המיקרופלואידיקה; הוא מייצר טיפות מימיות מרובות בשמן, וה-PCR מופיע בכל טיפה כתגובה בודדת12. התגובה מתרחשת בטיפות בודדות ומנותחת באמצעות קורא טיפות, אשר נותן את מספר הטיפות חיוביות או שליליות עבור הגן המעניין12. זוהי הטכניקה הרגישה ביותר לכימות מדויק של גן בעל עניין, גם אם יש רק עותק אחד בדגימה נתונה. ירידה ברגישות כלפי מעכבים, דיוק טוב יותר והשמטת גן הייחוס לכימות הופכים אותו ליתרון יותר מאשר qPCR13,14,15 קונבנציונלי. הוא נמצא בשימוש נרחב ככלי מחקר ואבחון לכימות מוחלט של גן בעל עניין16,17. כאן נתאר את פרוטוקול dd-PCR המפורט לכימות circRNA בהבחנה בין מיוטובים C2C12 של עכברים לבין מיובלסטים של עכברים מתרבים C2C12 באמצעות פריימרים מסתעפים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר CircRNA גדל בעשור האחרון עם גילוי טכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה. כתוצאה מכך, היא נחשבה למולקולה פוטנציאלית לטיפולי RNA עתידיים. בנוסף, ידוע כי הוא משמש כסמן ביולוגי במספר מחלות, כולל סרטן ומחלות לב וכלי דם 4,8. עם זאת, הזיהוי של circRNA הוא מסובך בגלל השפע הנמוך של…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון תוך-מוחי מהמכון למדעי החיים, מענק המחקר DBT (BT/PR27622/MED/30/1961/2018), ומלגת Wellcome Trust/DBT India Alliance [IA/I/18/2/504017] שהוענקה לאמארש ג. פנדה. אנו מודים לחברי מעבדה אחרים על הגהת המאמר.
Materials
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
- Chen, L. L., Yang, L. Regulation of circRNA biogenesis. RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).
- Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
- Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
- Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
- Panda, A. C., Xiao, J. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).
- Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. Emerging role of circular RNA-protein interactions. Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).
- Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
- Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
- Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Untergasser, A., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
- Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
- Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
- Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
- Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).
