Detta protokoll beskriver den detaljerade metoden för digital dropp-PCR (dd-PCR) för exakt kvantifiering av cirkulära RNA -nivåer (circRNA) i celler med hjälp av divergerande primers.
Digital dropppolymeraskedjereaktion (dd-PCR) är en av de mest känsliga kvantifieringsmetoderna; det fraktionerar reaktionen i nästan 20 000 vatten-i-oljedroppar, och PCR förekommer i de enskilda dropparna. dd-PCR har flera fördelar jämfört med konventionell qPCR i realtid, inklusive ökad noggrannhet vid detektering av mål med låg förekomst, utelämnande av referensgener för kvantifiering, eliminering av tekniska replikat för prover och visning av hög motståndskraft mot hämmare i proverna. Nyligen har dd-PCR blivit en av de mest populära metoderna för att exakt kvantifiera mål-DNA eller RNA för genuttrycksanalys och diagnostik. Cirkulära RNA (circRNA) är en stor familj av nyligen upptäckta kovalent slutna RNA-molekyler som saknar 5 ‘och 3’ ändar. De har visat sig reglera genuttryck genom att fungera som svampar för RNA-bindande proteiner och mikroRNA. Dessutom utsöndras circRNA i kroppsvätskor, och deras motståndskraft mot exonukleas gör att de fungerar som biomarkörer för sjukdomsdiagnos. Denna artikel syftar till att visa hur man utför divergerande primerdesign, RNA-extraktion, cDNA-syntes och dd-PCR-analys för att exakt kvantifiera specifika cirkulära RNA (circRNA) nivåer i celler. Sammanfattningsvis demonstrerar vi den exakta kvantifieringen av circRNA med hjälp av dd-PCR.
De senaste framstegen inom RNA-sekvenseringsteknik och nya beräkningsalgoritmer har upptäckt en ny medlem av den växande familjen av icke-kodande RNA, kallat cirkulärt RNA (circRNA)1. Som namnet antyder är circRNA en familj av enkelsträngade RNA-molekyler utan fria ändar. De bildas av icke-kanonisk head-to-tail-skarvning som kallas back-skarvning, där uppströms skarvacceptorplatsen förenas kovalent med nedströms skarvdonatorstället för att bilda en stabil RNA-cirkel 1,2. Denna process kan förmedlas av flera faktorer, inklusive inverterade Alu-repetitiva element som finns i uppströms och nedströms cirkulära exoner, eller kan förmedlas av vissa skarvningsfaktorer eller RNA-bindande proteiner (RBP)2,3. Cirkulära RNA som genereras uteslutande från den exoniska eller introniska sekvensen klassificeras som exoniskt circRNA och cirkulära introniska RNA eller ci-RNA, medan vissa exoniska circRNA behåller intron och kallas exon-intron circRNA (EIcircRNA)3,4. CircRNA: s funktioner är mångfacetterade, inklusive sponging miRNA och / eller RBP, reglering av transkription och reglering av cellulär funktion genom att översätta till peptider 3,5,6,7. Flera rapporter har belyst betydelsen av circRNA i olika sjukdomar och fysiologiska processer8. Dessutom gör vävnadsspecifika uttrycksmönster och resistens mot exonukleassmältning det till en funktionell biomarkör för sjukdomsdiagnos och det kan också användas som ett lämpligt terapeutiskt mål8. Med tanke på dess betydelse för att reglera hälsa och sjukdomar är den exakta kvantifieringen av circRNA-uttryck behovet av timmen.
Flera biokemiska metoder har utvecklats för att kvantifiera circRNA i biologiska prover9. En av de mest praktiska och allmänt accepterade metoderna för circRNA-kvantifiering är omvänd transkription följt av kvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) med användning av divergerande primerpar10. Majoriteten av circRNA är dock i låg överflöd jämfört med linjära mRNA, vilket gör det utmanande att kvantifiera dem11. För att lösa detta problem försökte vi använda digital dropp-PCR (dd-PCR) för att kvantifiera antalet circRNA i ett givet prov exakt. dd-PCR är en avancerad PCR-teknik som följer mikrofluidikprincipen; det genererar flera vattenhaltiga droppar i olja, och PCR förekommer i varje droppe som en individuell reaktion12. Reaktionen sker i enskilda droppar och analyseras med hjälp av en droppläsare, vilket ger antalet positiva eller negativa droppar för genen av intresse12. Det är den mest känsliga tekniken för att exakt kvantifiera en gen av intresse, även om det bara finns en enda kopia i ett givet prov. Minskad känslighet för hämmare, bättre precision och utelämnande av referensgenen för kvantifiering gör den mer fördelaktig än konventionell qPCR13,14,15. Det har använts i stor utsträckning som ett forsknings- och diagnostiskt verktyg för absolut kvantifiering av en gen av intresse16,17. Här beskriver vi det detaljerade dd-PCR-protokollet för circRNA-kvantifiering vid differentiering av mus C2C12-myorör och prolifererande mus C2C12-myoblaster med hjälp av divergerande primers.
CircRNA-forskningen har vuxit under det senaste decenniet med upptäckten av sekvenseringsteknik med hög genomströmning. Som ett resultat har det ansetts vara en potentiell molekyl för framtida RNA-terapier. Dessutom är det känt att fungera som en biomarkör vid flera sjukdomar, inklusive cancer och hjärt-kärlsjukdomar 4,8. Identifieringen av circRNA är dock knepig på grund av dess låga överflöd och den har bara en specifik backsplice-korsningssekvens…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av intramural finansiering från Institute of Life Sciences, DBT-forskningsbidraget (BT/PR27622/MED/30/1961/2018) och Wellcome Trust/DBT India Alliance Fellowship [IA/I/18/2/504017] som tilldelades Amaresh C. Panda. Vi tackar andra labbmedlemmar för korrekturläsning av artikeln.
1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
Filter Tips | Tarson | 528104 | |
DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
Chloroform | SRL | 96764 | |
DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |