المقايسة الحيوية الفتاكة باستخدام الأرتيميا سالينا L.
Summary
يهدف هذا العمل إلى تقييم ومراجعة إجراء الفحص الحيوي للفتك بالأرتيميا ، والذي تم تحديده أيضا على أنه اختبار فتك الجمبري الملحي. توفر هذه الطريقة البسيطة والرخيصة معلومات حول السمية العامة (التي تعتبر تقييما أوليا للسمية) للعينات ، أي المنتجات الطبيعية.
Abstract
تم استخدام المنتجات الطبيعية منذ العصور القديمة لإنتاج الأدوية. في الوقت الحاضر ، هناك الكثير من أدوية العلاج الكيميائي التي يتم الحصول عليها من مصادر طبيعية وتستخدم ضد عدد كبير من الأمراض. لسوء الحظ ، غالبا ما تظهر معظم هذه المركبات سمية جهازية وتأثيرات ضارة. من أجل تقييم أفضل لتحمل عينات مختارة يحتمل أن تكون نشطة بيولوجيا ، يستخدم الجمبري الملحي (Artemia salina) بشكل عام كنموذج في دراسات الفتك. يعتمد اختبار A. salina على قدرة المركبات النشطة بيولوجيا المدروسة على قتل القشريات الدقيقة في مرحلة اليرقات (nauplii). تمثل هذه الطريقة نقطة انطلاق ملائمة لدراسات السمية الخلوية ، وكذلك لفحص السمية العامة للمنتجات الاصطناعية وشبه الاصطناعية والطبيعية. يمكن اعتباره مقايسة بسيطة وسريعة ومنخفضة التكلفة ، مقارنة بالعديد من المقايسات الأخرى (الخلايا المختبرية أو سلالات الخميرة ، الزرد ، القوارض) مناسبة بشكل عام للأغراض المذكورة أعلاه ؛ علاوة على ذلك ، يمكن إجراؤه بسهولة حتى بدون أي تدريب محدد. بشكل عام ، تمثل مقايسة A. salina أداة مفيدة لتقييم السمية الأولية للمركبات المختارة والتجزئة الموجهة بيولوجيا لمستخلصات المنتجات الطبيعية.
Introduction
كانت المنتجات الطبيعية من النباتات أو الحيوانات أو الكائنات الحية الدقيقة مجال اهتمام متزايد على مر السنين في تطوير جزيئات نشطة بيولوجيا جديدة بسبب مجموعتها المتنوعة من الأنشطة البيولوجية والدوائية1. ومع ذلك ، فإن الآثار الجانبية المرتبطة ، أو مقاومة الأدوية ، أو عدم كفاية خصوصية العوامل ، خاصة عند استخدامها كأدوية مضادة للسرطان ، تمثل العوامل الرئيسية التي يمكن أن تؤدي إلى علاج غير فعال 1,2.
على مدى العقود القليلة الماضية ، تم اكتشاف العديد من العوامل السامة للخلايا المشتقة من النباتات ، بعضها يستخدم كعوامل مضادة للسرطان1،2،3. في هذا السياق ، تم الإبلاغ عن باكليتاكسيل كواحد من أشهر أدوية العلاج الكيميائي وأكثرها نشاطا من أصل طبيعي 3,4. حاليا ، تشير التقديرات إلى أن أكثر من 35 ٪ من جميع الأدوية في السوق مشتقة من أو مستوحاة من المنتجات الطبيعية5. تتطلب السمية العالية المحتملة لهذه المركبات النظر فيها خلال جميع مراحل الدراسة ، لأن الأنواع المختلفة من الملوثات أو حتى المكونات الأيضية للنبات نفسه يمكن أن تسبب تأثيرات سامة. لهذا السبب ، ينبغي إجراء الملامح الدوائية والسمية في المرحلة الأولية ، لتقييم النشاط البيولوجي وسلامة العلاجات النباتية المحتملة الجديدة. لتقييم سمية العينات النشطة بيولوجيا الجديدة ، يمكن اعتبار الحيوانات اللافقارية أفضل النماذج للدراسة. إنهم يطالبون بحد أدنى من المتطلبات الأخلاقية ويسمحون بإجراء فحوصات أولية في المختبر ، لإعطاء الأولوية للمنتجات الواعدة للجولة التالية من الاختبار في الفقاريات 1,6.
يعرف A. salina باسم الجمبري الملحي ، وهو عبارة عن لافقاريات صغيرة محبة للملح تنتمي إلى جنس Artemia (عائلة Artemiidae ، رتبة Anostraca ، subphylum Crustacea. الشكل 1). وفي النظم الإيكولوجية البحرية والمائية المالحة، يلعب الجمبري المالح دورا غذائيا هاما لأنه يتغذى على الطحالب الدقيقة وهو أحد مكونات العوالق الحيوانية المستخدمة لتغذية الأسماك. علاوة على ذلك ، تستخدم يرقاتها (المعروفة باسم nauplii) على نطاق واسع في تقييم السمية العامة خلال الدراسات الأولية1،3،7.
الأرتيميا spp. تستخدم على نطاق واسع في دراسات الفتك وهي أيضا نقطة انطلاق ملائمة لتقييم السمية ، من خلال تتبع سمية المركبات النشطة بيولوجيا المحتملة بناء على قدرتها على قتل nauplii المزروعة في المختبر 1,8. لهذا السبب ، اكتسب استخدام A. salina جاذبية في دراسات السمية العامة ، لأنها طريقة فعالة للغاية وسهلة الاستخدام ، مقارنة بالاختبارات الأخرى على النماذج الحيوانية9.
نظرا لتشريحها البسيط وحجمها الصغير ودورة حياتها القصيرة ، يمكن دراسة عدد كبير من اللافقاريات في تجربة واحدة. على هذا النحو ، فإنها تجمع بين قابلية الملاءمة الوراثية والتوافق منخفض التكلفة مع الفحوصات واسعة النطاق1. في هذا السياق ، يظهر استخدام الجمبري الملحي في مقايسة السمية العامة العديد من المزايا ، مثل النمو السريع (هناك حاجة إلى 28-72 ساعة من الفقس إلى النتائج الأولى) ، والفعالية من حيث التكلفة ، والعمر الافتراضي الطويل للبيض التجاري ، والتي يمكن استخدامها على مدار السنة 3,10. من ناحية أخرى ، نظرا لأن اللافقاريات لديها نظام عضوي بدائي وتفتقر إلى نظام المناعة التكيفي ، فإنها لا تمثل نموذجا مثاليا وموثوقا للخلايا البشرية1.
ومع ذلك ، فإنه يوفر طريقة تقييم أولية للسمية العامة للعينات المختارة. نظرا لأنه يستخدم على نطاق واسع كاختبار مميت ، فإنه يمكن أن يوفر مؤشرات مؤقتة حول التأثيرات السامة للعوامل المضادة للسرطان المحتملة. وغالبا ما يستخدم أيضا للحصول على تغذية مرتدة حول السمية العامة للمركبات التي تتمتع بأي أنشطة بيولوجية أخرى من الضروري إظهار أدنى معدل نفوق ممكن بين جمبري الأرتيميا .
في دراسة مستمرة من مجموعتنا ، أظهرت مقتطفات مختلفة من أنواع Plectranthus أنشطة مضادة للأكسدة ومضادة للميكروبات (نتائج غير منشورة). في موازاة ذلك ، تم الحصول على المركبات المعزولة عن طريق تنقية المستخلصات ثم تم تعديلها كيميائيا. ثم تم اختبار المستخلصات والمركبات النقية والمشتقات شبه الاصطناعية من حيث السمية العامة. في هذا السياق ، يهدف هذا العمل إلى إعطاء لمحة عامة عن استخدام المقايسة الحيوية الفتاكة الأرتيميا لتقييم السمية العامة والنشاط السام للخلايا المحتمل للمستخلصات النشطة بيولوجيا والمركبات المعزولة من نباتات مختلفة من جنس Plectranthus11.
الشكل 1: الأرتيميا المالحة تحت المجهر. nauplii حديث الفقس من A. salina كما يظهر تحت المجهر (التكبير 12x). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Protocol
Representative Results
Discussion
خلال السنوات الأخيرة ، زاد المجتمع العلمي من اهتمامه بالنماذج البديلة لفحوصات السمية21. بجانب الفحص الحيوي لفتك A. salina ، عادة ما يتم إجراء منهجيات أخرى لتقييم تحمل العينات وتشمل المقايسات الحيوية للفقاريات (مثل القوارض) ، واللافقاريات (مثل الزرد) ، والطرق المختبرية ب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
في ذكرى البروفيسور أميلكار روبرتو.
تم دعم هذا العمل ماليا من قبل Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT ، البرتغال) في إطار المشروعين UIDB / 04567/2020 و UIDP / 04567/2020 المنسوبين إلى CBIOS ومنحة الدكتوراه SFRH / BD / 137671/2018 (Vera Isca).
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | – | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | – | – | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | – |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | – | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | – | – | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 – 100 °C |
References
- Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
- Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114 (2021).
- Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263 (2018).
- Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
- Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
- Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
- Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
- Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147 (2022).
- Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
- Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
- Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170 (2012).
- Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
- Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082 (2021).
- Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20 (2015).
- Svensson, B. -. M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
- Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895 (2021).
- Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
- Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
- Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
- Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
- Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345 (2020).
- Fischer, I., Milton, C., Wallace, H. Toxicity testing is evolving. Toxicology Research. 9 (2), 67-80 (2020).
- de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
- Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
- Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cunliffe, V. T., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194 (2020).
- Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
- Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).
