Letalität Bioassay mit Artemia salina L.
Summary
Diese Arbeit zielt darauf ab, das Artemia salina lethality Bioassay-Verfahren, das auch als Solegarnelen-Letalitätstest bezeichnet wird, zu bewerten und zu überprüfen. Diese einfache und kostengünstige Methode gibt Aufschluss über die allgemeine Toxizität (die als vorläufige Toxizitätsbewertung betrachtet wird) von Proben, nämlich Naturstoffen.
Abstract
Naturprodukte werden seit der Antike zur Herstellung von Medikamenten verwendet. Heutzutage gibt es viele Chemotherapeutika, die aus natürlichen Quellen gewonnen und gegen eine Vielzahl von Krankheiten eingesetzt werden. Leider zeigen die meisten dieser Verbindungen oft systemische Toxizität und Nebenwirkungen. Um die Verträglichkeit ausgewählter potentiell bioaktiver Proben besser beurteilen zu können, werden in der Regel Salzgarnelen (Artemia salina) als Modell in Letalitätsstudien verwendet. Der A. salina-Test basiert auf der Fähigkeit der untersuchten bioaktiven Verbindungen, die Mikrokrebstiere in ihrem Larvenstadium (Nauplien) abzutöten. Diese Methode stellt einen geeigneten Ausgangspunkt für Zytotoxizitätsstudien sowie für das allgemeine Toxizitätsscreening von synthetischen, halbsynthetischen und natürlichen Produkten dar. Es kann als einfacher, schneller und kostengünstiger Assay angesehen werden, verglichen mit vielen anderen Assays (In-vitro-Zellen oder Hefestämme, Zebrafische, Nagetiere), die im Allgemeinen für die oben genannten Zwecke geeignet sind. Darüber hinaus kann es auch ohne spezielle Schulung problemlos durchgeführt werden. Insgesamt stellt der A. salina-Assay ein nützliches Werkzeug für die vorläufige Toxizitätsbewertung ausgewählter Verbindungen und die biogesteuerte Fraktionierung von Naturstoffextrakten dar.
Introduction
Naturstoffe aus Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen sind im Laufe der Jahre aufgrund ihres vielfältigen biologischen und pharmakologischen Wirkungsspektrums ein wachsendes Interesse an der Entwicklung neuer bioaktiver Moleküle 1. Die damit verbundenen Nebenwirkungen, die Arzneimittelresistenz oder die unzureichende Spezifität der Wirkstoffe, insbesondere wenn sie als Krebsmedikamente eingesetzt werden, stellen jedoch die Hauptfaktoren dar, die zu einer unwirksamen Behandlung führen können 1,2.
In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere pflanzliche Zytostatika entdeckt, von denen einige als Krebsmittel eingesetzt werden 1,2,3. In diesem Zusammenhang wird Paclitaxel als eines der bekanntesten und wirksamsten Chemotherapeutika natürlichen Ursprungs bezeichnet 3,4. Derzeit wird geschätzt, dass mehr als 35 % aller Arzneimittel auf dem Markt aus Naturprodukten stammen oder von diesen inspiriert sind5. Die potentiell hohe Toxizität dieser Verbindungen muss in allen Untersuchungsphasen berücksichtigt werden, da verschiedene Arten von Schadstoffen oder sogar Stoffwechselbestandteile der Pflanze selbst toxische Wirkungen hervorrufen können. Aus diesem Grund sollten in der Vorphase pharmakologische und toxikologische Profile erstellt werden, um die biologische Aktivität und Sicherheit neuer potenzieller pflanzlicher Behandlungen zu bewerten. Um die Toxizität neuer bioaktiver Proben zu bewerten, können wirbellose Tiere als die besten Modelle für die Untersuchung angesehen werden. Sie fordern ethische Mindestanforderungen und erlauben vorläufige In-vitro-Assays, um die vielversprechendsten Produkte für die nächste Testrunde an Wirbeltieren zu priorisieren 1,6.
A. salina ist ein kleines halophiles wirbelloses Tier aus der Gattung Artemia (Familie Artemiidae, Ordnung Anostraca, Unterstamm Crustacea; Abbildung 1). In marinen und aquatischen Salzökosystemen spielen Salzgarnelen eine wichtige ernährungsphysiologische Rolle, da sie sich von Mikroalgen ernähren und Bestandteile des Zooplanktons sind, das zur Fütterung von Fischen verwendet wird. Darüber hinaus werden ihre Larven (bekannt als Nauplien) häufig bei der Beurteilung der allgemeinen Toxizität in Vorstudienverwendet 1,3,7.
Artemia spp. werden häufig in Letalitätsstudien verwendet und sind auch ein geeigneter Ausgangspunkt für Toxizitätsbewertungen, indem sie die Toxizität potenziell bioaktiver Verbindungen basierend auf ihrer Fähigkeit, im Labor gezüchtete Nauplien abzutöten, verfolgen 1,8. Aus diesem Grund hat die Verwendung von A. salina in allgemeinen Toxizitätsstudien an Attraktivität gewonnen, da es sich im Vergleich zu anderen Tests an Tiermodellen um eine sehr effiziente und einfach anzuwendende Methode handelt9.
Aufgrund ihrer einfachen Anatomie, ihrer winzigen Größe und ihres kurzen Lebenszyklus kann eine große Anzahl von wirbellosen Tieren in einem einzigen Experiment untersucht werden. Als solche kombinieren sie genetische Zugänglichkeit und kostengünstige Kompatibilität mit groß angelegten Screenings1. In diesem Zusammenhang zeigt die Verwendung von Salzgarnelen in einem allgemeinen Toxizitätstest mehrere Vorteile, wie z.B. schnelles Wachstum (28-72 h ist vom Schlüpfen bis zu den ersten Ergebnissen erforderlich), Kosteneffizienz und lange Haltbarkeit von kommerziellen Eiern, die das ganze Jahr über verwendet werden können 3,10. Auf der anderen Seite, da wirbellose Tiere ein primitives Organsystem haben und kein adaptives Immunsystem haben, stellen sie kein perfektes und zuverlässiges Modell für menschliche Zellendar 1.
Es bietet jedoch eine vorläufige Bewertungsmethode für die allgemeine Toxizität ausgewählter Proben. Da es häufig als Letalitätstest verwendet wird, kann es vorläufige Hinweise auf die toxischen Wirkungen potenzieller Krebsmittel geben. Es wird oft auch verwendet, um Rückmeldungen über die allgemeine Toxizität von Verbindungen zu erhalten, die mit anderen biologischen Aktivitäten ausgestattet sind, für die es unerlässlich ist, eine möglichst niedrige Sterblichkeitsrate bei den Artemia-Garnelen zu zeigen.
In einer laufenden Studie unserer Gruppe zeigten verschiedene Extrakte aus Plectranthus-Arten antioxidative und antimikrobielle Aktivitäten (unveröffentlichte Ergebnisse). Parallel dazu wurden durch Aufreinigung der Extrakte isolierte Verbindungen erhalten und anschließend chemisch modifiziert. Die Extrakte, reinen Verbindungen und halbsynthetischen Derivate wurden dann auf ihre allgemeine Toxizität getestet. In diesem Zusammenhang zielt die vorliegende Arbeit darauf ab, einen Überblick über die Verwendung des Artemia lethality Bioassays zur Bewertung der allgemeinen Toxizität und potenziellen zytotoxischen Aktivität von bioaktiven Extrakten und isolierten Verbindungen aus verschiedenen Pflanzen der Gattung Plectranthus11 zu geben.
Abbildung 1: Artemia salina unter dem Mikroskop. Frisch geschlüpfte Nauplien von A. salina unter dem Mikroskop (12-fache Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In den letzten Jahren hat die wissenschaftliche Gemeinschaft ihre Aufmerksamkeit auf alternative Modelle für Toxizitätsscreenings gelenkt21. Neben dem Bioassay A. salina lethality werden in der Regel andere Methoden zur Bewertung der Probenverträglichkeit durchgeführt und umfassen Wirbeltier-Bioassays (z. B. Nagetiere), Wirbellose (wie Zebrafische), In-vitro-Methoden mit Hefestämmen oder -zellen und In-silico-Methoden 22,23,24,25<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
In Erinnerung an Professor Amilcar Roberto.
Diese Arbeit wurde von der Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) im Rahmen der Projekte UIDB/04567/2020 und UIDP/04567/2020 finanziell unterstützt, die CBIOS und dem Promotionsstipendium SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca) zugeschrieben wurden.
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | – | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | – | – | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | – |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | – | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | – | – | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 – 100 °C |
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