Summary
Dette arbeidet tar sikte på å evaluere og gjennomgå Artemia salina lethality bioassay prosedyre, også identifisert som saltlake reker dødelighetsanalyse. Denne enkle og billige metoden gir informasjon om den generelle toksisiteten (betraktet som en foreløpig toksisitetsevaluering) av prøver, nemlig naturlige produkter.
Abstract
Naturlige produkter har blitt brukt siden antikken for å produsere medisiner. I dag er det mange kjemoterapeutiske stoffer hentet fra naturlige kilder og brukt mot en mengde sykdommer. Dessverre viser de fleste av disse forbindelsene ofte systemisk toksisitet og bivirkninger. For bedre å evaluere toleransen til utvalgte potensielt bioaktive prøver, brukes saltlake reker (Artemia salina) vanligvis som modell i dødelighetsstudier. A. salina-testen er basert på evnen til de studerte bioaktive forbindelsene til å drepe mikrokrepsdyrene i larvestadiet (nauplii). Denne metoden representerer et praktisk utgangspunkt for cytotoksisitetsstudier, samt for generell toksisitetsscreening av syntetiske, semisyntetiske og naturlige produkter. Det kan betraktes som en enkel, rask og rimelig analyse, sammenlignet med mange andre analyser (in vitro-celler eller gjærstammer, sebrafisk, gnagere) generelt egnet for de nevnte formålene; Videre kan det enkelt utføres selv uten spesifikk trening. Samlet sett representerer A. salina-analysen et nyttig verktøy for foreløpig toksisitetsevaluering av utvalgte forbindelser og biostyrt fraksjonering av naturlige produktekstrakter.
Introduction
Naturlige produkter fra planter, dyr eller mikroorganismer har vært et voksende interesseområde gjennom årene i utviklingen av nye bioaktive molekyler på grunn av deres varierte utvalg av biologiske og farmakologiskeaktiviteter. Imidlertid representerer de tilknyttede bivirkningene, stoffresistensen eller utilstrekkelig spesifisitet av midlene, spesielt når de brukes som kreftmedisiner, de viktigste faktorene som kan føre til ineffektiv behandling 1,2.
I løpet av de siste tiårene har flere planteavledede cytotoksiske midler blitt oppdaget, noen av dem brukt som kreftmidler 1,2,3. I denne sammenheng er paklitaksel rapportert som et av de mest kjente og mest aktive kjemoterapeutiske legemidlene av naturlig opprinnelse 3,4. For tiden er det anslått at mer enn 35% av alle medisiner på markedet er avledet fra eller er inspirert av naturlige produkter5. Den potensielle høye toksisiteten til disse forbindelsene krever vurdering i alle studiefasene, siden forskjellige typer forurensninger eller til og med metabolske komponenter i selve planten kan forårsake toksiske effekter. Av denne grunn bør farmakologiske og toksikologiske profiler utføres i den foreløpige fasen for å vurdere den biologiske aktiviteten og sikkerheten til nye potensielle plantebaserte behandlinger. For å evaluere toksisiteten til nye bioaktive prøver, kan virvelløse dyr betraktes som de beste modellene å studere. De krever minimale etiske krav og tillater foreløpige in vitro-analyser, for å prioritere de mest lovende produktene for neste testrunde hos virveldyr 1,6.
Vanligvis kjent som saltlake reker, er A. salina en liten halofil virvelløse dyr som tilhører slekten Artemia (familie Artemiidae, orden Anostraca, subphylum Crustacea; Figur 1). I marine og akvatiske saltvannsøkosystemer spiller saltlake reker en viktig ernæringsmessig rolle når de spiser på mikroalger og er bestanddeler av dyreplanktonet som brukes til å mate fisk. Videre er larvene deres (kjent som nauplii) mye brukt i vurderingen av generell toksisitet under foreløpige studier 1,3,7.
Artemia spp. er mye brukt i dødelighetsstudier og er også et praktisk utgangspunkt for toksisitetsvurderinger, ved å spore toksisiteten til potensielt bioaktive forbindelser basert på deres evne til å drepe nauplii dyrket i laboratoriet 1,8. Av denne grunn fikk bruken av A. salina tiltrekning i generelle toksisitetsstudier, fordi det er en svært effektiv og brukervennlig metode, sammenlignet med andre tester på dyremodeller9.
På grunn av deres enkle anatomi, lille størrelse og korte livssyklus, kan et stort antall hvirvelløse dyr studeres i et enkelt eksperiment. Som sådan kombinerer de genetisk egnethet og rimelig kompatibilitet med storskala screenings1. I denne sammenheng viser bruk av saltlake reker i en generell toksisitetsanalyse flere fordeler, for eksempel rask vekst (28-72 timer er nødvendig fra klekking til de første resultatene), kostnadseffektivitet og lang holdbarhet for kommersielle egg, som kanbrukes hele året 3,10. På den annen side, siden hvirvelløse dyr har et primitivt organsystem og mangler et adaptivt immunsystem, representerer de ikke en perfekt og pålitelig modell for humane celler1.
Det gir imidlertid en foreløpig evalueringsmetode for generell toksisitet av utvalgte prøver. Siden det er mye brukt som en dødelighetsanalyse, kan den gi foreløpige indikasjoner på de toksiske effektene av potensielle anticancermidler. Det brukes ofte også til å få tilbakemelding om den generelle toksisiteten av forbindelser utstyrt med andre biologiske aktiviteter som det er viktig å vise lavest mulig dødelighet blant Artemia reker.
I en pågående studie fra vår gruppe viste forskjellige ekstrakter fra Plectranthus-arter antioksidanter og antimikrobielle aktiviteter (upubliserte resultater). Parallelt ble isolerte forbindelser oppnådd ved rensing av ekstraktene og ble deretter kjemisk modifisert. Ekstraktene, rene forbindelser og semisyntetiske derivater ble deretter testet med hensyn til generell toksisitet. I denne sammenheng tar dette arbeidet sikte på å gi en oversikt over bruken av Artemia lethality bioassay for evaluering av generell toksisitet og potensiell cytotoksisk aktivitet av bioaktive ekstrakter og isolerte forbindelser fra forskjellige planter av slekten Plectranthus11.
Figur 1: Artemia salina under mikroskopet. Nyklekkede nauplii av A. salina sett under mikroskopet (forstørrelse 12x). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Protocol
Representative Results
Discussion
I løpet av de siste årene har det vitenskapelige samfunnet økt sin oppmerksomhet mot alternative modeller for toksisitetsscreeninger21. Ved siden av A. salina letalitetsbioassay utføres andre metoder vanligvis for evaluering av prøvetoleranse og inkluderer vertebratbioassays (som gnagere), hvirvelløse dyr (som sebrafisk), in vitro-metoder ved bruk av gjærstammer eller celler, og i silico-metoder 22,23,24,25</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Til minne om professor Amilcar Roberto.
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) under prosjektene UIDB/04567/2020 og UIDP/04567/2020 tilskrevet CBIOS og PhD-stipend SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | – | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | – | – | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | – |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | – | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | – | – | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 – 100 °C |
References
- Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
- Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114 (2021).
- Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263 (2018).
- Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
- Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
- Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
- Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
- Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147 (2022).
- Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
- Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
- Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170 (2012).
- Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
- Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082 (2021).
- Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20 (2015).
- Svensson, B. -. M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
- Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895 (2021).
- Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
- Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
- Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
- Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
- Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345 (2020).
- Fischer, I., Milton, C., Wallace, H. Toxicity testing is evolving. Toxicology Research. 9 (2), 67-80 (2020).
- de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
- Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
- Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cunliffe, V. T., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194 (2020).
- Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
- Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).
