एक उपन्यास 3 डी मुद्रित धारक का उपयोग करके बरकरार पूर्व विवो ग्लोब्स की लाइव-सेल इमेजिंग
Summary
वर्तमान कार्य एक नए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो एक 3 डी मुद्रित धारक का उपयोग करता है ताकि एन्यूक्लिएटेड ग्लोब के उच्च-रिज़ॉल्यूशन लाइव सेल इमेजिंग को सक्षम किया जा सके। इस प्रोटोकॉल के माध्यम से, पूर्व विवो ग्लोब से घायल कॉर्नियल एपिथेलियम में सेलुलर कैल्शियम सिग्नलिंग गतिविधि वास्तविक समय में देखी जा सकती है।
Abstract
कॉर्नियल उपकला घाव भरने एक प्रवासी प्रक्रिया है जो उपकला कोशिकाओं पर व्यक्त प्यूरीनेर्जिक रिसेप्टर्स के सक्रियण से शुरू होती है। इस सक्रियण के परिणामस्वरूप कैल्शियम जुटाने की घटनाएं होती हैं जो कोशिका से कोशिका तक फैलती हैं, जो घाव बिस्तर में सेलुलर गतिशीलता शुरू करने के लिए आवश्यक हैं, कुशल घाव भरने को बढ़ावा देती हैं। ट्रिंकॉस-रैंडल प्रयोगशाला ने वास्तविक समय में विवो म्यूरिन ग्लोब में कॉर्नियल घाव भरने की प्रतिक्रिया की इमेजिंग के लिए एक पद्धति विकसित की है। इस दृष्टिकोण में एक माउस से एक बरकरार ग्लोब को एन्यूक्लिएटिंग करना शामिल है जिसे स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार इच्छामृत्यु दी गई है और तुरंत कैल्शियम इंडिकेटर डाई के साथ ग्लोब को इनक्यूबेट करना शामिल है। एक काउंटरस्टेन जो सेल की अन्य विशेषताओं को दागता है, इस स्तर पर इमेजिंग में सहायता करने और सेलुलर लैंडमार्क दिखाने के लिए लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल ने काउंटरस्टेनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले कई अलग-अलग लाइव सेल रंगों के साथ अच्छी तरह से काम किया, जिसमें एक्टिन को दागने के लिए एसआईआर एक्टिन और कोशिका झिल्ली को दागने के लिए गहरे लाल प्लाज्मा झिल्ली का दाग शामिल है। घाव की प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए, कॉर्नियल एपिथेलियम को 25 जी सुई का उपयोग करके घायल किया जाता है, और ग्लोब को 3 डी मुद्रित धारक में रखा जाता है। प्रयोग की अवधि के दौरान दुनिया के स्थिरीकरण को सुनिश्चित करने के लिए 3 डी मुद्रित धारक के आयामों को कैलिब्रेट किया जाता है और विभिन्न आकारों की आंखों को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। घाव प्रतिक्रिया की लाइव सेल इमेजिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके समय के साथ ऊतक में विभिन्न गहराई पर लगातार की जाती है। यह प्रोटोकॉल हमें कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर 20x वायु उद्देश्य का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन, प्रकाशन-गुणवत्ता वाली छवियों को उत्पन्न करने की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल के लिए अन्य उद्देश्यों का भी उपयोग किया जा सकता है। यह एक्स विवो म्यूरिन ग्लोब में लाइव सेल इमेजिंग की गुणवत्ता में एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करता है और नसों और उपकला की पहचान की अनुमति देता है।
Introduction
कार्निया
कॉर्निया आंख की पूर्ववर्ती सतह को कवर करने वाली एक स्पष्ट, संवहनी संरचना है जो दृष्टि को सक्षम करने के लिए प्रकाश को अपवर्तित करती है और आंख के इंटीरियर को नुकसान से बचाती है। जैसा कि कॉर्निया पर्यावरण के संपर्क में है, यह यांत्रिक कारणों (खरोंच) और संक्रमण दोनों से नुकसान के लिए अतिसंवेदनशील है। एक अन्यथा स्वस्थ रोगी में कॉर्नियल की चोट आमतौर पर 1-3 दिनों के भीतर ठीक हो जाती है। हालांकि, लिम्बल स्टेम सेल की कमी और टाइप 2 मधुमेह सहित अंतर्निहित स्थितियों वाले रोगियों में, कॉर्नियल घाव भरने की प्रक्रियाबहुत लंबी हो सकती है। चूंकि कॉर्निया अत्यधिक आंतरिक है, ये गैर-उपचार कॉर्नियल अल्सर और आवर्तक कॉर्नियल क्षरण बहुत दर्दनाक हैंऔर उन्हें अनुभव करने वाले रोगियों के जीवन की गुणवत्ता को बहुत कम करते हैं।
सेल सिग्नलिंग
जब एक अन्यथा स्वस्थ कॉर्निया घायल हो जाता है, तो घाव से सटे कोशिकाओं में कैल्शियम सिग्नलिंग की घटनाएं घाव के बिस्तर में सेलुलर प्रवास से पहले और प्रेरित करती हैं, जहां वे 2,3 के जोखिम के बिना चोट को बंद कर देते हैं। लाइव सेल इमेजिंग 2 का उपयोग करके कॉर्नियल एपिथेलियल सेल कल्चर मॉडल में इन सिग्नलिंग घटनाओं को अच्छी तरह से चित्रित किया गयाहै। प्रारंभिक प्रयोगों में मधुमेह कोशिकाओं की तुलना में गैर-मधुमेह कोशिकाओं में चोट के बाद काफी अधिक कैल्शियम सिग्नलिंग का प्रदर्शन किया गया है। हालांकि, एक्स विवो ग्लोब्स में सेल सिग्नलिंग घटनाओं का लक्षण वर्णन एक तकनीकी चुनौती साबित हुआ है।
लाइव सेल इमेजिंग
पिछले अध्ययनों ने कॉर्नियल घाव भरने के इन विट्रो सेल कल्चर मॉडल से कैल्शियम सिग्नलिंग घटनाओं को सफलतापूर्वक दर्ज किया है। पूर्व विवो ऊतक में इन सिग्नलिंग घटनाओं की उच्च गुणवत्ता वाली छवियों का उत्पादन करने के लिए एक पद्धति विकसित करना बहुत रुचि का है क्योंकि यह इन घटनाओं के अध्ययन को अधिक जटिल और सच्चे-से-जीवन प्रणाली में अध्ययन करने की अनुमति देगा। पिछले दृष्टिकोणों में कॉर्निया का विच्छेदन शामिल है, जिसके बाद यूवी-प्रेरित पीईजी जेल 7,8,9 में स्थिरीकरण होता है। जीवित ऊतक के साथ काम करते समय स्थिरीकरण एक आवश्यक लेकिन चुनौतीपूर्ण कदम है, क्योंकि यह प्रयोग के दौरान व्यवहार्य और हाइड्रेटेड रहना चाहिए। इसके अलावा, स्थिरीकरण ऊतक को नुकसान नहीं पहुंचाना चाहिए। जबकि पीईजी समाधान ने ऊतक को स्थिर कर दिया, उत्पादित छवियों का संकल्प और गुणवत्ता सुसंगत नहीं थी। इसलिए, ऊतक क्षति के कम जोखिम के साथ उच्च गुणवत्ता वाली छवियों का उत्पादन करने के लिए बरकरार ग्लोब को स्थिर करने के लिए 3 डी मुद्रित धारकों को विकसित किया गया था।
दृष्टिकोण
लाइव सेल इमेजिंग के लिए बरकरार पूर्व विवो ग्लोब को स्थिर करने के लिए एक अद्वितीय 3 डी मुद्रित धारक विकसित किया गया था। यह धारक दो प्रमुख स्रोतों से क्षति को रोकता है: यह कॉर्निया को विच्छेदित करने की आवश्यकता के बिना एक एन्यूक्लिएटेड ग्लोब की इमेजिंग की अनुमति देता है, और यह यूवी प्रकाश के संपर्क को समाप्त करता है। क्षति के इन स्रोतों के बिना, प्राप्त छवियों ने प्रयोगात्मक रूप से किए गए खरोंच की चोटों की प्रतिक्रिया का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व किया। इसके अलावा, 3 डी मुद्रित धारक को मुराइन आंख के सटीक आयामों के लिए कैलिब्रेट किया गया था। इसने पीईजी समाधान में स्थिरीकरण की तुलना में बहुत बेहतर फिट प्रदान किया, जिससे ऊतक आंदोलन में कमी के कारण कम शक्ति वाले उद्देश्यों पर उच्च गुणवत्ता वाली छवि बनी। धारक के शीर्ष से जुड़ी एक कवर पट्टी यह सुनिश्चित करती है कि प्रयोग की अवधि के दौरान ग्लोब स्थिर रहता है और जब हाइड्रेशन और व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए विकास मीडिया लागू किया जाता है तो ग्लोब का कोई विस्थापन नहीं होता है। सटीक आयामों पर धारक को प्रिंट करने की क्षमता भी हमें उम्र या बीमारी की स्थिति के कारण विभिन्न आकारों की मुराइन आंखों के लिए एक इष्टतम फिट उत्पन्न करने की अनुमति देती है। इस तकनीक को उनके आयामों के आधार पर विभिन्न प्रजातियों की आंखों के लिए धारकों को विकसित करने के लिए अधिक व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल एक लाइव सेल इमेजिंग तकनीक का वर्णन करता है जो बरकरार पशु आंखों को स्थिर और स्थिर करने के लिए 3 डी मुद्रित धारक का उपयोग करता है। यह पूर्व विवो कॉर्नियल ऊतक के पिछले लाइव सेल इमेजिंग प्रो?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम निम्नलिखित अनुदान सहायता के लिए एनआईएच को स्वीकार करना चाहते हैं: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS), और 5T32GM008541-24 (KS)। हम मैसाचुसेट्स लायंस आई रिसर्च फंड और न्यू इंग्लैंड कॉर्नियल ट्रांसप्लांट फंड को भी स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
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