Imaging di cellule vive di globi ex vivo intatti utilizzando un nuovo supporto stampato in 3D
Summary
Il presente lavoro descrive un nuovo protocollo sperimentale che utilizza un supporto stampato in 3D per consentire l’imaging di cellule vive ad alta risoluzione di globi enucleati. Attraverso questo protocollo, l’attività di segnalazione del calcio cellulare nell’epitelio corneale ferito da globi ex vivo può essere osservata in tempo reale.
Abstract
La guarigione della ferita epiteliale corneale è un processo migratorio avviato dall’attivazione dei recettori purinergici espressi sulle cellule epiteliali. Questa attivazione si traduce in eventi di mobilizzazione del calcio che si propagano da cellula a cellula, che sono essenziali per iniziare la motilità cellulare nel letto della ferita, promuovendo un’efficiente guarigione della ferita. Il laboratorio Trinkaus-Randall ha sviluppato una metodologia per l’imaging della risposta di guarigione delle ferite corneali in globi murini ex vivo in tempo reale. Questo approccio prevede l’enucleazione di un globo intatto da un topo che è stato eutanasia secondo protocolli stabiliti e l’incubazione immediata del globo con un colorante indicatore di calcio. Una contromacchia che colora altre caratteristiche della cellula può essere applicata in questa fase per aiutare con l’imaging e mostrare punti di riferimento cellulari. Il protocollo ha funzionato bene con diversi coloranti di cellule vive utilizzati per la controcolorazione, tra cui l’actina SiR per colorare l’actina e la colorazione della membrana plasmatica rosso intenso per colorare la membrana cellulare. Per esaminare la risposta a una ferita, l’epitelio corneale viene ferito utilizzando un ago da 25 G e i globi vengono posizionati in un supporto stampato in 3D. Le dimensioni del supporto stampato in 3D sono calibrate per garantire l’immobilizzazione del globo per tutta la durata dell’esperimento e possono essere modificate per ospitare occhi di diverse dimensioni. L’imaging cellulare vivo della risposta della ferita viene eseguito continuamente a varie profondità in tutto il tessuto nel tempo utilizzando la microscopia confocale. Questo protocollo ci consente di generare immagini ad alta risoluzione e di qualità pubblicativa utilizzando un obiettivo aereo 20x su un microscopio confocale. Altri obiettivi possono essere utilizzati anche per questo protocollo. Rappresenta un miglioramento significativo nella qualità dell’imaging di cellule vive in globi murini ex vivo e consente l’identificazione di nervi ed epitelio.
Introduction
Cornea
La cornea è una struttura avascolare chiara che copre la superficie anteriore dell’occhio che rifrange la luce per consentire la visione e protegge l’interno dell’occhio dai danni. Poiché la cornea è esposta all’ambiente, è suscettibile di danni sia da cause meccaniche (graffi) che da infezioni. Una lesione corneale in un paziente altrimenti sano guarisce in genere entro 1-3 giorni. Tuttavia, nei pazienti con condizioni di base tra cui deficit di cellule staminali limbari e diabete di tipo II, il processo di guarigione della ferita corneale può essere notevolmente prolungato1. Poiché la cornea è altamente innervata, queste ulcere corneali non cicatrizzanti e le erosioni corneali ricorrenti sono molto dolorose e diminuiscono notevolmente la qualità della vita dei pazienti che le sperimentano1.
Segnalazione cellulare
Quando una cornea altrimenti sana è ferita, gli eventi di segnalazione del calcio nelle cellule adiacenti alla ferita precedono e inducono la migrazione cellulare nel letto della ferita, dove chiudono la lesione senza il rischio di cicatrici 2,3. Questi eventi di segnalazione sono stati ben caratterizzati in modelli di coltura cellulare epiteliale corneale utilizzando l’imaging cellulare vivo2. Gli esperimenti preliminari dimostrano significativamente più segnalazione di calcio dopo la lesione nelle cellule non diabetiche rispetto alle cellule diabetiche. Tuttavia, la caratterizzazione degli eventi di segnalazione cellulare nei globi ex vivo si è rivelata una sfida tecnica.
Imaging cellulare vivo
Studi precedenti hanno registrato con successo eventi di segnalazione del calcio da modelli di coltura cellulare in vitro di guarigione della ferita corneale 4,5,6. Lo sviluppo di una metodologia per produrre immagini di alta qualità di questi eventi di segnalazione in tessuto ex vivo è di grande interesse perché consentirebbe lo studio di questi eventi in un sistema più complesso e realistico. Gli approcci precedenti hanno comportato la dissezione della cornea seguita dall’immobilizzazione in un gel PEG indotto dai raggi UV 7,8,9. L’immobilizzazione è un passo essenziale ma impegnativo quando si lavora con tessuti vivi, in quanto deve rimanere vitale e idratato per tutto il corso dell’esperimento. Inoltre, l’immobilizzazione non deve danneggiare il tessuto. Mentre la soluzione PEG immobilizzava il tessuto, la risoluzione e la qualità delle immagini prodotte non erano coerenti. Pertanto, i supporti stampati in 3D sono stati sviluppati per immobilizzare globi intatti per produrre immagini di qualità superiore con meno rischi di danni ai tessuti.
L’approccio
È stato sviluppato un esclusivo supporto stampato in 3D per immobilizzare globi ex vivo intatti per l’imaging di cellule vive. Questo supporto previene i danni da due fonti principali: consente l’imaging di un globo enucleato senza la necessità di sezionare la cornea ed elimina l’esposizione alla luce UV. Senza queste fonti di danno, le immagini ottenute rappresentavano più accuratamente la risposta alle lesioni da graffio fatte sperimentalmente. Inoltre, il supporto stampato in 3D è stato calibrato alle dimensioni precise dell’occhio murino. Ciò ha fornito un adattamento molto migliore rispetto all’immobilizzazione nella soluzione PEG, portando a un’immagine di qualità superiore a obiettivi a bassa potenza a causa della diminuzione del movimento dei tessuti. Una barra di copertura attaccata alla parte superiore del supporto assicura che il globo rimanga immobile per tutta la durata dell’esperimento e che non vi sia alcuno spostamento del globo quando vengono applicati terreni di crescita per mantenere l’idratazione e la vitalità. La possibilità di stampare il supporto su dimensioni precise ci consente anche di generare una vestibilità ottimale per occhi murini di diverse dimensioni a causa dell’età o dello stato di malattia. Questa tecnologia può essere applicata in modo più ampio per sviluppare supporti per gli occhi di diverse specie in base alle loro dimensioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive una tecnica di imaging cellulare vivo che utilizza un supporto stampato in 3D per stabilizzare e immobilizzare gli occhi degli animali intatti. È progettato per aggirare diversi svantaggi significativi riconosciuti con precedenti protocolli di imaging di cellule vive del tessuto corneale ex vivo . Questo protocollo offre molti vantaggi per l’imaging di cellule vive di globi intatti. Riduce significativamente i danni tissutali non necessari che potrebbero interferire con la risposta di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere il NIH per il seguente sostegno di sovvenzione: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) e 5T32GM008541-24 (KS). Vorremmo anche riconoscere il Massachusetts Lions Eye Research Fund e il New England Corneal Transplant Fund.
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
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